Лабораторная диагностика гонореи

В последнее время изменилось клиническое течение гонореи как у мужчин, так и у женщин.

Заболевание нередко протекает торпидно, без выраженных клинических проявлений. Ввиду этого лабораторная диагностика гонореи приобрела особо важное значение. Без хорошо поставленных лабораторных исследований успешная борьба с гонореей невозможна.

Основными методами лабораторной диагностики гонореи являются бактериоскопический и бактериологический. При типичной клинической картине заболевания, если бактериоскопическое исследование обнаруживает гонококк, в применении бактериологического метода нет необходимости. Лабораторный работник высокой квалификации лишь в редких случаях при бактериоскопическом исследовании может принять за гонококки другие микроорганизмы. При установлении излеченности и выявлении бактериоскопически атипичных гонококков, а также для подтверждения диагноза гонореи у детей необходима бактериологическая диагностика.

Материалом для бактериоскопического исследования обычно являются отделяемое слизистой оболочки уретры и прямой кишки у мужчин, выделения уретры, шейки матки, прямой кишки у женщин, влагалища и прямой кишки у девочек. Кроме того, исследованию подлежат все материалы, подозрительные на наличие гонококков, Материал для исследования должен брать лечащий врач, так как он, учитывая клинику заболевания у данного больного, может выбрать наиболее пригодный для исследований материал.

У мужчин отделяемое слизистой оболочки берут петлей из глубины уретры, предварительно очистив ее отверстие тампоном, смоченным изотоническим раствором хлорида натрия. При малом количестве выделений до взятия материала производят массаж уретры в дистальном направлении. У женщин патологическое отделяемое из уретры, бартолиновых желез и парауретральных ходов берут ложкой Фолькмана или петлей, из шейки матки — влагалищным пинцетом или петлей при обязательном использовании влагалищных зеркал. Материал из прямой кишки получают либо путем промывания ее ампулы теплым изотоническим раствором хлорида натрия с помощью катетера с двойным током жидкости, либо соскабливая его со слизистой оболочки анального канала ложкой Фолькмана. Последнему методу дал положительную оценку М.Д. Мастбаум, проводивший сравнительное изучение эффективности различных лабораторных методов при диагностике аноректальной гонореи. При обследовании на фарингеальную гонорею специально обработанным ватным тампоном берут материал из лакун миндалин и с задней стенки глотки выше нижнего края мягкого неба. К мазкам, направляемым в лабораторию, должен быть приложен сопроводительный бланк, в которой указывают фамилию и инициалы больного, предполагаемый диагноз или причину обследования и откуда, взят материал.

Мазки на одном стекле окрашивают 1 % водным раствором метиленового синего или 0,5 % водным раствором бриллиантовой зеленого в течение 1 мин, на другом — по способу Грама.

Для выявления в мазках эозинофилов целесообразно их окрашивать эозином и метиленовым синим. Для этого требуется 1 % раствор эозина на 60—70 % спирте и 1 % водный раствор метиленового синего. Мазок, высушенный на воздухе, заливают раствора эозина на 15 с, промывают водой и заливают раствором метиленового синего на 1 мин, вновь промывают водой и высуживают.

Для окраски по Граму требуется: 1) 1 % водный раствор кристаллического фиолетового. Краску растворяют в кипящей дистиллированной воде, раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр; 2) раствор Люголя: I г чистого йода, 2 г йодида калия, 300 мл дистиллированной воды; 3) 96 % этиловый спирт: 4) 1 % водный раствор нейтрального красного.

До окраски мазок фиксируют в 96 % этиловом спирте. Высуженный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги размером немного меньше стекла и заливают раствором кристаллического фиолетового на 1 мин. Бумагу снимают, мазок промывают водой и заливают раствором Люголя до его почернения, после чего раствор сливают, стекло с мазком погружают в ванночку со спиртом для обесцвечивания. Обесцвечивание производят иод контролем глаза, погружая и вынимая мазок из спирта до тех пор, пока с тонких мест не перестанут стекать окрашенные струйки спирта. Мазок в этих местах приобретает бледно-серый цвет. Препарат быстро промывают водой, заливают раствором нейтрального красного на 3 мин, после чего промывают водой и высушивают.

Мазками, окрашенными метиленовым синим, эозином с мегиленовым синим или бриллиантовым зеленым, можно пользоваться для ориентировочной микроскопии. Окончательное заключение дают только на основании окраски по Граму. В противном случае возможны ошибки даже у опытных лабораторных работников, так как и другая бактериальная флора может располагаться внутриклеточно и иметь сходство с гонококком. При правильной окраске по Граму ядра лейкоцитов и эпителиальных клеток должны быть частично окрашены в фиолетовый цвет, а гонококки розовые. Диагностировать гонорею можно только на основании правильно окрашенного по Граму мазка. Если не удается хорошо окрасить препарат, то можно перекрасить по Граму второй мазок, окрашенный метиленовым синим. При этом иммерсионное масло снимают ксилолом, бензином или спиртом и красят так, как если бы мазок не был ранее окрашен.

В мазках патологического материала от больных свежей гонореей гонококки располагаются как внутри, так и внеклеточно, почти одинаковой величины и формы, грамотрицательны. При хронической гонорее гонококков обычно меньше, чем при свежей.

Внутриклеточно расположенные гонококки встречаются реже, величина и форма диплококков не всегда одинаковы, но при внимательном исследовании препарата можно найти типичные гонококки. При нахождении измененных или только единичных типичных форм следует давать описательный ответ и рекомендовать бактериологическое исследование. В заключении лаборатории должно быть отмечено наличие, другой бактериальной флоры, трихомонад, грибов рода кандида, а также количество форменных элементов (лейкоциты, эпителий).

При проведении бактериологического исследования в нашей стране используют асцит-агар или беаасцитные питательные среды. В.Н. Беднова, М.B. Яцуха предложили 4 варианта безасцитной среды:

1) мясо-пептонный агар (pH 7,4—7,5) из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (100 мл), обогащенный гидролизатом казеина (2 мг), дрожжевым аутолизатом (2 мл) и сывороткой крови крупного рогатого скота (20 мл);

2) мясо-пептонный агар (100 мл), обогащенный гемогидролизатом (2 мл), дрожжевым аутолизатом (2 мл) и сывороткой крови крупного рогатого скота (20 мл);

3) мясо-пептонный агар (100 мл), обогащенный средой 199 для культур тканей (20 мл), дрожжевым аутолизатом (2 мл) и сывороткой крови крупного рогатого скота (20 мл);

4) мясо-пептонный агар (100 мл), обогащенный желтком куриного яйца (10 мл) и сывороткой крови крупного рогатого скота (20 мл).

Все ингредиенты, взятые для обогащения, смешивают по прописи, добавляют к расплавленному и остуженному до 50—56 °C мясо-пептонному агару, хорошо перемешивают, разливают в пробирки по 3,5 мл и скашивают. В каждую пробирку добавляют по 0,5 мл мясо-пептонного бульона или изотонического раствора хлорида натрии для увлажнения. Среды проверяют на стерильность при 37 °C в течение 24 ч.

Безасцитная среда по первому рецепту в лиофилизированном состоянии выпускается производственными предприятиями в двух, флаконах: в первом — основа среды, во втором — обогащающие добавки. Перед употреблением в первый флакон добавляют 100 мл стерильной дистиллированной воды, выдерживают 10 мин при комнатной температуре, а затем на водяной бане при 100 °C до полного растворения среды. Во второй флакон добавляют 24 мл стерильной дистиллированной воды, выдерживают при комнатной температуре до полного растворения содержимого флакона. После охлаждения до 50—56 °C основы среды ее смешивают с обогащающими добавками, разливают по 3,5 мл в стерильные пробирки, скашивают, увлажняют и проверяют на стерильность. Внедрение в практику высококачественной сухой среды, срок годности которой 12 мес, дает возможность расширить бактериологическую диагностику гонореи.

При посеве материала, загрязненного посторонней флорой в частности из ротоглотки и прямой кишки, необходимо пригонять среды с добавлением антибиотиков полимиксина M сульфата в концентрации 20 ЕД/мл и линкомицина гидрохлорида в концентрации 2 м кг/мл. Эти антибиотики подавляют рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, не влияя на рост гонококков. При посеве материала из ротоглотки Г.C. Капцева предложила добавлять к среде, помимо антибиотиков, оротовую кислоту в дозе 1 мкг/мл.

Непосредственный посев патологического материала на питательные среды дает наилучший результат, но если невозможно произвести бактериологическое исследование на месте, то можно пользоваться транспортными средами, которые служат только для сохранения жизнеспособности гонококка. Наиболее распространена за рубежом среда Стюарта.

Транспортная среда в модификации ЦКВИ: 1) 1000 мл дистиллированной воды, свободной от хлора, 30 г агар-агара; 2) 900 мл дистиллированной воды, свободной от хлора, 2 мл тиогликоленой кислоты, 12 мл N раствора NaOH, 100 мл 20 % водного раствора однозамещенного фосфата натрия, 20 мл 1 % раствора хлорида кальция.

Смесь 2 прибавляют к свежерасплавленному агару (1), pH доводят до 7,3—7,4. Среду разливают в стерильные пробирки по К) мл. Стерилизуют текучим паром в течение часа.

Материал для посева берут ватным тампоном на палочке из нержавеющей стали, которую предварительно обрабатывают фосфатным буфером pH 7,4 и импрегнируют тонко измельченным древесным углем. Непосредственно после взятия материала тампон погружают в среду, после чего поверх пробки пробирку закрывают резиновой соской.

Материал в транспортной среде можно держать в холодильнике не более 24 ч, в лаборатории производят пересев на питательную среду.

Гонококк на искусственных питательных средах обычно дает рост через 24 ч в виде мелких росовидных колоний, бесцветных ми слегка беловатых в проходящем свете. Кран колоний ровные, поверхность гладкая и блестящая. При микроскопическом исследовании мазков, приготовленных из таких колоний, гонококки имеют вид кокков или диплококков одинаковой величины; они грамотрицательны. Через 48—72 ч размеры колоний увеличиваются. При микроскопическом исследовании мазков из таких колоний гонококки полиморфные, отдельные экземпляры слабо окрашены, число гонококков с типичной морфологией невелико. Иногда вокруг колоний наблюдаются бородавчатые разрастания или валики — дочерние колонии.

С.М. Шеркевич разработал методику выявления у больных L-форм гонококка, выделил их у 26,9 % больных с воспалительными заболеваниями мочеполовых органов, ранее безуспешно обследованных на гонорею.

В процессе жизнедеятельности гонококк вырабатывает фермент оксидазу. Несмотря на то что это свойство присуще не только гонококку, но и другим микроорганизмам, в частности некоторым штаммам кишечной палочки, дифтероидов, грибов рода кандида и др., его используют при бактериологической диагностике гонореи. Чтобы не остались незамеченными единичные колонии гонококка в смешанной культуре, поверхность роста заливают 1 % раствором парафенилендиамина или 0.5 % раствором тетраметил-парафенилендиамина гидрохлорида. При этом колонии микроорганизмов, вырабатывающих оксидазу, в том числе и смешанные окрашиваются сначала в красный, а затем в черный цвет. Из смешанных колоний необходимо дополнительно сделать мазки для микроскопического исследования. Следует учитывать, что гонококк в обработанных указанными выше растворами колониях гибнет в течение нескольких минут.

За рубежом для выявления гонококков предложено использовать прямой иммунофлюоресцентный метод: тонкие мазки из патологического отделяемого фиксируют на пламени или спиртом и обрабатывают меченной изотиоцианатом антигонококковой сывороткой. Затем мазки промывают в двух порциях фосфатного буфера pH 7,3, наносят на них каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом и исследуют в люминесцентном микроскопе. Н.М. Овчинников, С.С. Лурье, В.Н. Беднова получили лучшие результаты при предварительном окрашинании препаратов 1 % спиртовым раствором эозина и метиленовым синим. При таком способе окраски получается более характерное свечение гонококков, позволяющее отличить их от других микроорганизмов.

Deacon рекомендует так называемый замедленный метод, представляющий собой комбинацию бактериологического исследования и иммунофлюоресцентного окрашивания. Делают посев патологического материала на плотные Питательные среды и через 16—24 ч выдерживания в термостате готовят мазки из культур, которые затем обрабатывают флюоресцирующей антигонококковой сывороткой. Замедленный метод позволяет выявить небольшое число гонококков, что зачастую наблюдается при хронической гонорее. Замедленный метод не нашел широкого распространения, потому что промышленность не выпускает антигонококковые флюоресцирующие сыворотки.

Серологические исследования, в частности реакция Борде — Жангу, имеют определенное значение при распознавании гонореи, особенно хронической и осложненной. По нашим данным, положительный результат реакции отмечен у 73,8 % женщин с урогенитальной гонореей.

Применявшаяся реакция определения гонококкового антигена в настоящее время не используется, прежде всего из-за отсутствия антигонококковой сыворотки с высоким титром специфических антител. За рубежом для определения антигена в патологическом отделяемом от больных применяют аппарат «Quantum» фирмы «Abbott», обеспечивающий выявление специфического антигена иммуноферментным методом.

На современном этапе важное значение приобретает активное выявление больных гонореей, для чего нужны высокочувствительные и простые отборочные тесты. Отдельные авторы пытались для этой цели применить внутрикожную пробу с аллергеном гонококка, но несовершенство способов его приготовления не позволило внедрить данный метод в практику. В 1970 г. В.Ф. Рунова предложила универсальный способ получения аллергенов из бактерий с высоким содержанием белка.

Изучение в ЦКВИ внутрикожной пробы с аллергеном гонококка, приготовленным по методу В.Ф. Pyновой, показало ее высокую чувствительность (85,6—87,9%) и специфичность (7% неспецифических результатов), что позволило рекомендовать этот тест в качестве отборочного на гонорею.