Перспективы применения лентивирусной трансдукции клеток мозга для доставки генов нейротрофинов в область «полутени» ишемического очага

В Российской Федерации ежегодно регистрируется более 450 000 случаев острого нарушения мозгового кровообращения (ОМНК). По распространенности данная патология находится на втором месте после сердечно-сосудистой патологии. Ранняя 30-дневная летальность после OMHK составляет 34,6%, а в течение года умирают около половины больных. Инсульт является лидирующей причиной инвалидизации населения. Лишь около 20% выживших больных могут вернуться к прежней работе. Причинами острого нарушения кровообращения могут быть закупорка мозговых кровеносных сосудов (ишемический инсульт), разрыв мозговых кровеносных сосудов (геморрагический инсульт).

Ишемический инсульт наиболее распространен, на его долю выпадает 70-85% всех случаев острого нарушения мозгового кровообращения. При падении скорости кровотока в месте закупорки сосуда до 10-20% от нормы в течение нескольких минут происходят необратимые изменения в нейронах и формируется центральная зона инфаркта («ядро ишемии», англ. core), до 20-40% — формируется «ишемическая полутень», или «пенумбра» (англ. penumbra), в этой области нейроны морфологически не изменяются, но с течением времени они погибают, увеличивая тем самым область ишемии.

Важной стратегией развития регенеративной постинсультной терапии является разработка и внедрение препаратов, направленных на стимуляцию нейротрофической поддержки клеток в поврежденных областях мозга. Нейротрофины (neurotrophin, греч. neuron — нерв, trophe — питание) — семейство секретируемых белков, отвечающих за рост отростков нервных клеток, дифференцировку, выживаемость и выполняющих свои функции путем связывания с Тгк-рецептором (tropomvosinre-сeptorkinase), трансмембранным рецептором тирозинкиназы.

Семейство нейротрофинов включает в себя фактор роста нервов (NGF, nerve growth factor), мозговой нейротрофический фактор (BDNF, brain-derived neuro-trophic factor), нейротрофин-3 и другие. Благодаря способности увеличивать выживаемость нейронов, нейротрофины рассматриваются как перспективные анти-нейродегенеративные средства. BDNF особенно привлекателен в этом отношении, так как он улучшает выживание и предупреждает дегенерацию популяций нейронов, вовлеченных в такие заболевания, как амиотрофический латеральный склероз (мотонейроны), сенсорные нейропатии (сенсорные нейроны), болезнь Альцгеймера (базальные холинергические нейроны переднего мозга), болезнь Паркинсона (дофаминергические нейроны черной субстанции). Кроме того, показано, что BDNF играет важную роль в этиологии болезни Хантингтона и депрессии.

Фактор роста нервов (nerve growth factor, NGF) выделяется клетками периферической и центральной нервной системы. Основными мишенями для NGF являются холинергические нейроны переднего мозга, играющие значительную роль в таких функциях ЦНС, как внимание, обучение, память, и большинство нейронов симпатической нервной системы. Мозговой нейротрофический фактор (Brain-derived neurotroph-ic factor, BDNF) способствует выживаемости нейронов дорсального спинного ганглия (ДСГ) в культуре и препятствует их гибели, если вводится in vivo эмбрионам во время периода естественной гибели нейронов. Популяциями клеток, чувствительными к BDNF, являются дофаминергические нейроны черной субстанции, мотонейроны, нейроны реснитчатого ганглия, ГАМК-ергические нейроны переднего, промежуточного мозга и стриатума, нейроны гиппокампа, некоторые сенсорные нейроны периферической нервной системы, холинергические нейроны переднего мозга. Рецепторы факторов роста являются гликопротеинами, встроенными в плазматическую мембрану. Нейротрофины взаимодействуют с двумя типами рецепторов на поверхности нейронов-мишеней: тирозинкиназным и р75-рецепторами.

Существует большой объем данных по нейропротекторным эффектам нейротрофинов в животных моделях нейродегенеративных заболеваний. Есть сведения, что NGF и BDNF вовлечены в патогенез таких заболеваний, как болезни Альцгеймера и Паркинсона. BDNF продемонстрировал значительные эффекты в ряде животных моделей бокового амиотрофического склероза и ишемии. Кроме того, BDNF оказал довольно сильный положительный эффект в моделях инсульта, что является сейчас крайне важным его свойством, остро востребованным в сегодняшней фармакологической практике. Также есть данные, что NGF влияет не только на нейроны, но и на эндотелиальные клетки мозговых капилляров (вместе они образуют нейроваскулярную единицу) и способствует их более быстрому восстановлению после ишемического повреждения. BDNF защищает от дефицита пространственной памяти, возникающей после гипоксии-ишемии у новорожденных. Недавно стало очевидно, что BDNF играет важную роль в долгосрочном потенциировании синаптической пластичности. Предполагается, что он также может играть определенную роль в образовании памяти и извлечении, проявляет антидепрессивную активность. Есть данные о том, что при выполнении физических упражнений после перенесенного инсульта происходит увеличение количества BDNF и его высокоаффинного рецептора TrkB в контралатеральном полушарии, тем самым доказывая участие BDNF в пластичности.

Таким образом, при всем широком спектре действия нейротрофинов одним из самых важных является нейропротекторное действие, способствующее восстановлению нейронов после повреждения. Эта их особенность способствует развитию и совершенствованию терапевтических подходов в лечении таких заболеваний, как инсульт мозга, болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, боковой амиотрофический склероз и ряд других.

Отдельной задачей является доставка нейротрофинов к поврежденным клеткам. Дело в том, что их размер не позволяет проникать через гематоэнцефаличес-кий барьер (ГЭБ). Существуют технологии доставки белка к клеткам: к белкам присоединяют агент, способствующий проникновению через ГЭБ. Есть работа, в которой делали инъекции нейротрофина (NGF) напрямую в мозг (в мозговые желудочки) для осуществления нейропротекции в модели фокальной ишемии мозга, осуществляемой пережатием средней мозговой артерии, но действие нейротрофина в таком случае оказалось неэффективным. Существуют и технологии доставки гена нейротрофина в клетку, с которого осуществляется экспрессия белка самой клеткой. Доставка гена осуществляется кодирующей плазмидой, проникновение которой в клетку можно осуществить in vivo электропорацией с использованием наносистем, генной пушки. Одним из удачных решений этой задачи является лентивирусная in vivo трансдукция клеток мозга, обеспечивающая долгосрочную экспрессию белка за счет встраивания гена нейротрофина в геном клетки мозга, тем самым обеспечивая ощутимый нейропротекторный эффект.

В частности, есть данные о том, что BDNF, доставленный лентивирусными частицами в латеральные желудочки мозга новорожденных мышей, имеет нейропротективное действие в модели эксайтотоксичности, вызванной NMDA. Доставка нейротрофинов NGF и BDNF с помощью адено-ассоциированных вирусных частиц в стриатум приводит к мягким функциональным улучшениям моторных нарушений, проявляющимся через 3-5 недель после инсульта, которые сочетаются с небольшим, но важным увеличением выживаемости дорсолатеральных нейронов стриатума. BDNF, доставленный адено-ассоциированными вирусными частицами за 2 недели в латеральные желудочки мозга крыс, уменьшал объем повреждения в модели инсульта, вызванного пережатием средней мозговой артерии в течение 30 минут, а также при его добавлении к нейронам за 2 дня увеличивал количество выживших гиппокампальных нейронов в культуре после удаления сыворотки. NGF, BDNF, GDNF, до ставляемые вирусом сендай в латеральные желудочки мозга песчанок, предотвращают отсроченную гибель пирамидных нейронов в поле CA1 гиппокампа после кратковременного обширного инсульта. Причем нейропротективное действие всех трех факторов NGF, BDNF, GDNF обнаруживается при введении после 30 минут, отсчитанных от начала реперфузии, и только NGF и GDNF имеют нейропротективное действие при введении после 4 и 6 часов.

В данной работе мы сфокусировали внимание на нейропротекции нейронов в области «полутени» ишемического очага, возникающего при ишемическом инсульте в коре больших полушарий мозга лабораторных животных, осуществляемой нейротрофинами, доставленными лентивирусными частицами. В частности, мы подобрали оптимальные параметры для осуществления тромбоза мозговых кровеносных сосудов с целью получения 50-процентной глубины повреждения от всей глубины коры, осуществили лентивирусную трансдукцию клеток коры больших полушарий мозга крыс, подобрав предварительно оптимальные условия, оценили объем инъекции, определили тип клеток, подвергшихся трансдукции.

В качестве модели ишемии был выбран фотохимический тромбоз кровеносных сосудов мозга, вызванный коагуляцией красителя «Бенгаловый розовый» под действием лазера. При подборе условий было использовано от 15 до 50% мощности лазера. Оценку объема повреждения проводили на 2-й, 4-й, 9-й, 15-й дни методом магнитно-резонансной томографии (томограф Bruker Biospec 70/30, с индуктивностью магнитного поля 7 Тл).

В результате были подобраны условия экспериментальной ишемии, при которых происходит повреждение 50% (по глубине) коры больших полушарий (рис. 1).

По данным МРТ, с течением времени область «ядра» и «полутени» прогрессивно уменьшаются. Область полутени после 5 суток выражена очень слабо (рис. 2).

При большом увеличении можно увидеть, что в области «полутени» на 2-й день после тромбоза мозговых сосудов появляются темные, пикнотические, набухшие нейроны. Также происходит отек-набухание нейропиля (рис. 3, 4).

Таким образом, согласно данным MPT и гистологического окрашивания, с течением времени область «ядра» и «полутени» прогрессивно уменьшается. Область полутени через 5 суток уменьшается в 2 раза, а после 5 суток выражена очень слабо. Можем сделать вывод, что самый оптимальный срок для оценки действия нейротрофических факторов на данной модели ишемии — 1-5 суток.

Суспензию лентивирусных частиц делали по отработанному протоколу. Инъекции лентивирусной суспензии осуществляли крысам-самцам линии Вистар. Животных оперировали в стереотаксическом приборе (Kopf, США). Делали саггитальный разрез на коже головы длиной 2-3 см. Верхнюю поверхность очищали от надкостницы. Трепанировали кость ручным трепаном (диаметр 3,1 мм) в области сенсомоторной коры, кость во внутреннем диаметре истончали бором до тех пор, пока не просматривались кровеносные сосуды. Выбирался участок, свободный от сосудов, делалось отверстие миллиметровым в диаметре сверлом. Суспензии лентивирусов (V=2 мкл) вводили с помощью наноинжектора (скорость подачи 0,5 мкл/мин) в кору больших полушарий, глубина 0,7 мм от поверхности мозга.

Для иммуногистохимического окрашивания готовили срезы мозга экспериментальных животных. Через 2 недели после осуществления инъекции лентивирусными частицами крыс анестезировали, мозг фиксировали методом транскардиальной перфузии 4-процентным параформальдегидом в 0,1 M фосфатно-солевом буфере. Затем мозг извлекали и оставляли для дофиксации в 4-процентном растворе параформальдегида в течение 24 часов. Срезы мозга толщиной 50 мкм делали на виб-ратоме LeicaVT 1200S.

Срезы отмывали в 300 мкл раствора PBS+0,05% Tween три раза по 10 минут. Отбирали и добавляли 500 мкл смеси PBS+0,05% Tween+5% сыворотка (normal goat serum, NGS, MPBiomedicals), инкубировали 1 час для блокировки неспецифического связывания антител в дальнейшем. Отбирали и добавляли первичные антитела кролика на зеленый флуоресцентный белок в растворе PBS+1% сыворотка (rabbitanti-GFP, Life Technologies, USA), инкубировали ночь при +4°С. После инкубации с первичными антителами делали 3 раза отмывку срезов по 10 минут на качалке в 1 мл смеси PBS и 0,05% Tween. Добавляли вторичные антитела козы на антитела кролика (goatanti-rabbit, Life Technologies, USA), образцы заворачивали в фольгу и инкубировали 3 часа на качалке. Отбирали антитела и делали 3 раза отмывку срезов по 10 минут в 1 мл смеси PBS и 0,05% Tween на качалке. Образцы помещали в среду, предотвращающую выцветание (Slow Fade Gold, Invitrogen). Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа LeicaDM6000B, фотографии получили с помощью камеры LeicaDFC310FX.

Для определения количества белка нейротрофинов (в частности фактора роста нервов, ФРН) через две недели после инъекции лентивирусных частиц в гиппокамп крыс использовали иммуноферментный анализ (ELISA). Образцы гомогенизировали в ледяном буфере для гомогенизации, супернатант был перенесен в лунки 96-луночного планшета с преконъюгированными антителами к ФРН. После инкубации при +4°С супернатант был удален и лунки промыты 5 раз буфером для отмывок. Первичные антитела мыши против ФРН были разведены 1:1000 непосредственно перед использованием и 100 мкл антител было помещено в каждую лунку. После инкубации (37°С, 3 часа на шейкере) лунки планшета промывали 5 раз буфером для отмывок. Вторичные антитела осла против антител мыши были разведены 1:1000 непосредственно перед использованием. Инкубацию и отмывки проводили аналогично тому, что делали с первичными антителами. Затем 100 мкл ТВМ/Е раствора (Millipore) помещали в каждую лунку. После инкубации 10 минут в лунки добавляли раствор для остановки реакции. Окрашивание оценивали с помощью Wallac Victor планшетного спектрофотометра.

В результате проведенных исследований было продемонстрировано, что инъекция суспензии лентивирусных частиц, несущих генетическую информацию для синтеза фактора роста нервов, увеличивает концентрацию ФРН в гиппокампе в 2 раза.

Таким образом, было получено подтверждение того, что полученную суспензию можно использовать в дальнейших экспериментах при моделировании нейропатологии.

В результате экспериментов по введению суспензии вирусных частиц, несущих генетический материал для экспрессии фактора роста нервов, нами продемонстрировано, что распространение лентивирусных частиц в коре больших полушарий по объему составляет в среднем 800 (ростро-каудальное направление), 1500 (дорсо-вентральное), 700 (медиалатеральное) мкм (рис. 5). После двойного окрашивания срезов (на GFP и маркеры нейрональных/глиальных клеток) нами было установлено, что при этом происходит преимущественная трансдукция глиальных клеток (рис. 6, 7).

Таким образом, мы показали, что довольно большой объем коры трансдуцируется лентивирусными частицами, преимущественно трансдуцируются глиальные клетки. Этот факт позволяет предположить, что глиальные клетки, находящиеся в поврежденном участке и продуцирующие нейротрофины, доставленные лентивирусными частицами, смогут внести вклад в восстановление поврежденных нейронов, а сами нейроны не будут нести дополнительной нагрузки по осуществлению синтеза нейротрофинов. Следующим этапом исследования будет сравнительный анализ нейропротекторной активности нейротрофинов NGF, BDNF, GDNF.

До настоящего момента не осуществлялось попыток доставить нейротрофины непосредственно в область «полутени» ишемического очага к нейронам, в которых, как считается, запускается механизм апоптоза и на которые, как мы предполагаем, могут повлиять нейротрофины с целью увеличения их выживаемости. Это комплексная задача, решение которой состоит из множества этапов. В нашей работе мы осуществили первые этапы: создали воспроизводимую модель ишемии, создали лентивирусные частицы, локально увеличивающие уровень нейротрофинов. Следующий непростой этап — это осуществить доставку нейротрофинов именно в зону «полутени» и оценить уровень нейропротекции, осуществляемую нейротр финами.