Моделирование FUS-протеинопатий in vitro (клеточные культуры)

Основные данные по механизмам агрегации FUS были получены в результате исследований в культвируемых клетках, в том числе в дрожжах. Обычно для изучения агрегации и токсичности используют повышенную экспрессию того или иного гена — модели, основанные на его сверхэкспресии.

В самых ранних работах для изучения способности к агрегации и токсичности белка FUS дрожжевые клетки трансформировали плазмидой для экспрессии FUS человека, слитого с желтым флуоресцентным белком (YFP). Чтобы избежать преждевременной гибели клеток дрожжей во время роста из-за возможной токсичности экзогенного FUS, для экспрессии FUS-YFP использовали галактоза-индуцируемый промотор. В отличие от клеток млекопитающих, в дрожжевых клетках нормальный белок FUS человека был большей частью сосредоточен в цитоплазме, что, возможно, связано с тем, что его NLS не узнается ядерными рецепторами дрожжей. В этих работах было показано, что повышенная концентрация FUS приводит к его агрегации в цитоплазме и токсична для дрожжевых клеток. При транслокации FUS в ядро, для достижения которой использовали FUS с NLS от SV40, уровень токсичности значительно снижался. Низкий уровень FUS, достигнутый с использованием слабого промотора, не был токсичен и не приводил к агрегации белка. Было также отмечено, что цитоплазматические агрегаты FUS-YFP в дрожжевых клетках были нестабильными, динамичными, напоминая Р-тельца и СГ. Под влиянием стресса FUS перераспределялся в Р-тельца и СГ. Более того, повышенная экспрессия FUS-YFP увеличивала частоту образования как Р-телец, так и СГ. Было показано, что для формирования агрегатов и токсичности FUS необходимы прионоподобный домен, РНК-связывающий мотив и домен RGG 2 (FUS1-422). При этом вариант, содержащий только прионоподобный домен и РНК-связывающий мотив (FUS1-371), не агрегировал и белок находился в ядре. При удалении N-конца токсичность не проявлялась, несмотря на то что белок накапливался в цитоплазме и агрегировал. Мутации в РНК-связывающем домене значительно уменьшали токсичность, при этом белок также агрегировал в цитоплазме.

И в дрожжевых клетках, и фибробластах домен RGG2 был необходим для агрегации в цитоплазме. Однако в клеточной культуре нейробластомы SH-SY5Y укороченный белок, FUS1-359, меченный GFP, агрегировал в цитоплазме. Белок FUS-YFP (50-526) также агрегировал в дрожжах и фибробластах, но образованные включения были меньше по размеру. FUS1-422 был токсичен in vivo, однако для проявления токсичности требовалась более высокая его концентрация по сравнению с полноразмерным белком. В обоих случаях образовавшиеся агрегаты варьировали от 15 до 20 нм в диаметре и по структуре напоминали патологические включения в пораженной нервной ткани больных БАС. Ассоциированные с БАС мутации в FUS не оказывали существенного влияния ни на формирование агрегатов, ни на их токсичность.

В ходе исследований in vitro с использованием очищенного рекомбинантного белка FUS было показано, что он обладает очень высокой агрегационной способностью. Выделение немеченного белка было трудно осуществимо из-за его быстрой агрегации, однако присутствие GST (глутатион-Б-трансферазы) на N-конце повышало растворимость FUS и позволило получить очищенный белок, который был способен к связыванию РНК. При этом при отщеплении GST с помощью протеазы TEV белок быстро агрегировал без какой-либо дополнительной стимуляции, например перемешивания. Агрегация также зависела от концентрации белка. Полученные агрегаты не окрашивались амилоидными красителями и растворялись в присутствии SDS, в отличие от агрегатов дрожжевого белка Sup35, несущего прионоподобный домен. Таким образом, был сделан вывод, что агрегаты FUS имеют неамилоидную природу. Тем не менее, вопрос о природе агрегатов FUS до сих пор остается открытым, в том числе и потому, что точный механизм интеркаляции красителей конго красного и тиофлафина Т (ThT) неизвестен, а рентгеноструктурный анализ и электронная микроскопия показали, что FUS образует P-слои, подобно амилоидам.

Еще в одной серии экспериментов попытались установить гены, способные модулировать токсичность FUS. В ходе скрининга в дрожжах было выявлено 10 генов, продукты которых повышали токсичность FUS, и 24 гена, продукты которых ее ослабляли, при этом все они были вовлечены в метаболизм РНК. Некоторые из этих генов имеют гомологи у человека, которые, возможно, могут также влиять на токсичность FUS у человека. Это подтвердилось на примере генов, кодирующих убиквитин-лигазу FBXW7 и фактор инициации трансляции EIF4A1 (гомологи дрожжей Cdc4 и Tif2, соответственно), которые супрессировали токсичность FUS и его мутантов R521C и R521H в культуре клеток млекопитающих НЕК293Т. Сходные результаты были получены на культуре клеток COS7. Кроме того, в список супрессоров вошли гены, продукты которых вовлечены в формирование СГ у дрожжей, — это факторы инициации трансляции Tif2, Tif3 и Pab и дрожжевой аналог белка РАВР-1 (polyA-binding protein 1) человека.

Несмотря на обширную информацию, полученную при анализе in vitro моделей, ряд вопросов по-прежнему оставался открытым, например, временные характиристики агрегации FUS, токсичность для разных типов клеток, в том числе и разных типов нейронов и т.д. Для ответа на эти вопросы необходимы были создание и характеристика in vivo моделей.