Изменения на молекулярном и биохимическом уровнях

Помимо функциональных и структурных изменений, вызванных пренатальной гипоксией, в нервной ткани экспериментальных животных наблюдались существенные перестройки на молекулярном и биохимическом уровнях. Это выражалось, прежде всего, в изменении экспрессии разных генов на уровне мРНК и белка, а также активности ряда ферментов (в частности, упомянутых выше каспаз) и систем трансдукции сигналов, в том числе холинергической медиации. Так, в постнатальном онтогенезе животных, перенесших пренатальную гипоксию, наблюдалась существенно иная динамика активности ацетил- и бутирилхолинэстераз (АХЭ и БХЭ) в сенсомоторной коре. Это проявлялось не только в снижении активности данных ферментов на определенных этапах развития мозга (в частности, в первый месяц постнатального развития и активного формирования межклеточных контактов), но также в изменении соотношения мембраносвязанной, выполняющей медиаторные функции, и растворимой формы АХЭ, выполняющей роль фактора роста нервов и участвующей в синаптогенезе. Более того, пренатальная гипоксия с возрастом приводила к повышению доли БХЭ в общей холинэстеразной акткивости, что может иметь компенсаторный характер, поскольку этот фермент играет важную роль в выведении из ткани мозга токсических агентов, которые могут образовываться в результате перенесенной гипоксии и нарушения нормального функционирования мозга. С другой стороны, повышение активности БХЭ в ткани мозга является одним из характерных признаков БА и может свидетельствовать о наличии нарушений, предрасполагающих к развитию нейродегенерации.

Анализ содержания предшественника амилоидного пептида (АРР) в сенсомоторной коре также выявил существенное изменение динамики экспрессии этого белка в постнатальном онтогенезе крыс, перенесших пренатальную гипоксию, в то время как гипоксия приводила к повышению содержания мембраносвязанной формы APP на всех анализируемых этапах развития, образование его растворимой формы (sAPP), обладающей нейритогенными свойствами, было снижено. При этом наиболее существенное снижение наблюдалось в период интенсивного синаптогенеза (Р10-Р30), когда недостаток данного нейритогенного фактора может привести к нарушению формирования нейрональных систем мозга. Полученные данные также свидетельствуют, что пренатальная гипоксия существенным образом модифицирует активность α-секретазы — фермента, играющего важную роль в образовании основного пула sAPP в нервной ткани и препятствующего формированию Аβ. Недостатком активности этого фермента можно объяснить снижение образования растворимой формы. В целом, повышение уровня содержания APP и снижение его неамилоидного расщепления под действием α-секретазы, вызванные пренатальной гипоксией, могут являться предпосылкой к сдвигу амилоидного метаболизма в сторону процессов, инициирующих развитие БА.

Важным фактором, который обуславливает накопление Aβ в ткани мозга при развитии спорадической формы БА, является дефицит активности амилоид-деградирующих ферментов и нарушение выведения избытков этого пептида из нервной ткани. Согласно нашим данным, пренатальная гипоксия приводит к снижению уровня экспрессии и активности основного амилоид-деградирующего фермента неприлизина (НЕП) и его гомолога эндотелин-конвертирующего фермента (ЭКФ, ЕСЕ-1), что может способствовать накоплению Aβ и развитию патологии, в частности, нарушению памяти. Подтверждением этому служат результаты наших экспериментов по введению ингибитора НЕП и ЭКФ фосфорамидона в кору мозга интактных взрослых крыс. Длительное i.e. введение фосфорамидона (2-10в-3 М, со скоростью 0,25 мкл в час в течение 28 суток посредством миниосмотических помп — Alzet, USA) вызывало у взрослых крыс нарушение кратковременной памяти в радиальном лабиринте и снижение среднего количества синаптоподин-позитивных шипиков в молекулярном слое коры мозга. Эти результаты согласуются с данными, полученными ранее в экспериментах с многократными (6-8 раз с интервалом в 1 сутки) одиночными i.e. введениями ингибиторов НЕП фосфорамидона или тиорфана.

У животных, перенесших пренатальную гипоксию, снижение активности НЕП наблюдается не только в коре, но и в гиппокампе. Однако в плазме крови этих животных мы наблюдали повышение активности НЕП по сравнению с контролем. Такое разнонаправленное изменение активности НЕП в ткани мозга и плазме крови может свидетельствовать о различиях в системе регуляции НЕП, экспрессируемого в центральной нервной системе и вне ее. Более того, повышение экспрессии НЕП в плазме может быть отражением компенсаторных изменений, направленных на снижение Aβ в нервной ткани посредством поддержания баланса, существующего между пулами Aβ в ткани мозга и крови.

Анализ экспрессии еще одной амилоид-деградирующей протеазы — инсулин-деградируещего фермента (ИДФ), в структурах мозга крыс после пренатальной гипоксии также показал снижение его содержания в разных структурах мозга. Так, на разных этапах постнатального онтогенеза, начиная с Р30 и заканчивая старыми животными (Р600), уровень содержания этого фермента в коре был на 40-50%, а в стриатуме на 30% ниже, чем в контроле. В гиппокампе наииболее существенное снижение ИДФ (на 60%) наблюдалось на Р20. Поскольку ИДФ играет важную роль в метаболизме инсулина, дефицит его активности после пренатальной гипоксии может приводить не только к развитию патологий, обусловленных накоплением Ар, но и к диабету.

В поисках средств повышения активности амилоид-деградирующих ферментов, в частности НЕП, уровень которого также существенно снижается с возрастом, были проведены интенсивные исследования с использованием клеточных моделей, которые существенно расширили наши представления о механизмах регуляции экспрессии гена этого фермента. Так, было убедительно показано, что экспрессия НЕП регулируется по принципу обратной связи цитоплазматическим фрагментом APP (AICD), который образуется одновременно с Aβ в результате действия на молекулу APP β- и γ-секретаз. С другой стороны, было установлено, что репрессия гена НЕП в нервных клетках осуществляется с помощью гистондеацетилаз, и их ингибирование (трихостатином А или вальпроатом натрия) приводит к повышению уровня экспрессии и активности НЕП. Другим классом соединений, способных повышать экспрессию и активность НЕП, являются антиоксиданты зеленого чая, в частности эпигаллокатехингаллат (EGCG), положительный эффект которых был показан при разных нейродегенеративных заболеваниях. В серии экспериментов на животных, подвергавшихся пренатальной гипоксии, нами было показано, что i.р. инъекции вальпроата натрия (200 мкг/кг веса, 2 недели) или i.e. введение EGCG (2-10в-3 M, посредством миниосмотических помп в течение 28 дней) существенно повышали уровень экспрессии и активности НЕП в коре и гиппокампе, приближая его к контрольным величинам. Повышение активности НЕП у этих животных коррелировало с числом правильных пробежек в радиальном лабиринте и восстановлением кратковременной и долговременной памяти в тесте распознавания новых объектов, а также с повышением количества лабильных шипиков в коре мозга (после введения вальпроата натрия) и в гиппокампе (после введения EGCG) по сравнению с животными, перенесшими пренатальную гипоксию и получавшими физраствор вместо тестируемых соединений.

В исследованиях по влиянию гипоксии на уровень экспрессии НЕП с использованием клеток нейробластомы человека NB7 показано, что снижение содержания мРНК и ферментативной активности НЕП при гипоксии сопровождается пониженным связыванием транскриационного фактора AICD с промотером его гена. Поскольку AICD является субстратом каспаз, которые активируются при гипоксии, нами был проведен анализ действия ингибитора каспаз Z-DEVD-FMK на уровнь НЕП и показано, что его добавление к клеткам до начала гипоксического воздействия восстанавливало связывание AICD с промотором НЕП и повышало уровень активности НЕП. Эти исследования показывают наличие связи между изменением эпигенетической регуляции нейрональных генов, уровнем нейрональной пластичности и активацией каспаз, поскольку последние могут не только регулировать содержание транскрипционных факторов, включая AICD, но также и белков цитоскелета и синаптического аппарата. Дальнейшие исследования с применением модели пренатальной гипоксии, несомненно, углубят наши представления о механизмах регуляции когнитивных функций на молекулярном уровне, которые могут лечь в основу создания средств профилактики когнитивных нарушений.