Исследование процессов нейрогенеза в инъекционных моделях болезни Альцгеймера

Возникновение ряда мнестических нарушений может быть связано с изменением процессов нейрогенеза в мозге. Действительно, возрастное снижение нейрогенеза в субвентрикулярной зоне (СВЗ) и субгранулярной зоне (СГЗ) гиппокампа является одной из причин функциональных нарушений памяти. Исследование нейрогенеза в биопсийном материале, полученном от больных БА, с использованием маркерных белков дифференцировки показало увеличение экспрессии белков незрелых клеток, таких как даблкортин (Dcx), полисиалилированный белок клеточной адгезии PSA-NCAM, нейрогенный фактор дифференцировки и TUC-4. В то же время, у пациентов с пресенильной стадией БА не было обнаружено усиления пролиферации нейральных предшественников, хотя число глиальных элементов, образованных de novo, возрастало. Было также установлено, что при БА происходит нарушение механизмов созревания новообразованных нейронов в зубчатой фасции (ЗФ). В других работах было многократно показано, что при БА пролиферация предшественников и их число существенно снижаются.

Использование нетрансгенных моделей БА также не позволяет сделать определенного заключения относительно влияния разных фрагментов белка-предшественника амилоида на нейрогенез. Так, введение в боковые желудочки мозга мышей Аβ(1-42) или Аβ(25-35) снижало уровень пролиферации клеток в СВЗ в течение последующих 5 дней. Похожие результаты были получены X. Ли и П. Зу, которые показали, что интрацеребровентрикулярная инъекция Аβ(25-35) сопровождается не только снижением нейрогенеза, но и нейродегенеративными изменениями в гиппокампе. Вместе с тем, увеличение пролиферации клеток в СВЗ также было продемонстрировано у мышей линии B6/DBA после введения Аβ(1-42). Стимулирующий эффект Аβ(1-42) на стволовые клетки был опосредован активацией рецептора p75NTR. Как видно из приведенных данных, результаты этих немногих работ так же противоречивы, как и полученные на мутантных животных. Практически отсутствуют данные для каких-либо других видов грызунов, кроме мышей.

Следует отметить, что в значительной степени противоречивость получаемых данных может быть обусловлена различиями в используемых авторами методических подходах к детекции процессов нейрогенеза даже на сходных экспериментальных моделях. В первую очередь это связано с различными протоколами введения тимидинового аналога 5′-бромо-2′-дезоксиуридинa (BrdU), который чаще всего используется для детекции пролиферации. У людей применение этого подхода невозможно, что затрудняет и без того непростую интерпретацию получаемых результатов. Так, единственное исследование, выполненное на материале, полученном от людей, и демонстрирующее увеличение содержания Dcx в гиппокампе при БА, основано только на данных вестерн-блот-анализа, который не позволяет сделать выводов о местоположении и распределении клеток, экспрессирующих этот белок. В то же время, гистологическое исследование в когорте более молодых пациентов с БА позволило сделать вывод о том, что изменения пролиферации в гиппокампе связаны, главным образом, с изменением числа глиальных и эндотелиальных клеток.

В нашей работе исследование пролиферации было проведено с использованием многократного введения BrdU в течение 5 дней после инъекции Аβ(25-35) в боковые желудочки мозга крыс. Было установлено, что Аβ(25-35) оказывал влияние на процессы пролиферации клеток и в СВЗ, и в СГЗ, но характер этих влияний был различным. В СВЗ число клеток, которые образовались в группе животных, инъецированных этим пептидом, не отличалось от контрольных крыс или крыс, получавших Аβ(35-25), но оставалось более высоким через 12 дней после операции, что может свидетельствовать об усилении пролиферации и/или нарушении миграционных процессов, связанных с действием Аβ(25-35). В СГЗ пролиферация клеток была снижена по сравнению с другими группами животных и через 6, и через 12 дней после операции.

Негативное влияние Аβ(1-42) и Аβ(25-35) при интрацеребровентрикулярном введении мышам было замечено в работе также при субхроническом введении BrdU. Авторы описали этот эффект на качественном уровне при унилатеральном введении 5 нмоль АР(1-42) и Аβ(25-35). Они показали также, что аппликация этих пептидов в культуру нейросфер, полученных из эмбриональной ткани, приводила к нарушению пролиферации и нейрональной дифференцировки нейросфер, связанному с дисбалансом Ca2+. Следует отметить, что в этой работе авторы использовали существенно меньшую дозу пептидов и более поздние сроки по сравнению с нашим исследованием. В то же время, был обнаружен стимулирующий пролиферацию нейросфер эффект Аβ(1-42) в культуре, полученной из СВЗ. Предполагают, что эти эффекты обусловлены активацией рецептора p75NTR.

Можно предположить, что стимулирующий эффект Aβ связан с длительным воздействием на относительно многочисленную популяцию делящихся клеток, которая включает в себя как непосредственно стволовые клетки, так и незрелые пролиферирующие нейробласты. Для того чтобы исследовать эффекты Аβ(25-35) на более однородную по составу группу клеток, была использована иная схема введения BrdU, при которой этот предшественник вводили крысам только в течение первых суток после инъекции Аβ(25-35). Иммуногистохимическая детекция включившегося BrdU была проведена через 6, 12 и 28 дней после инъекций Аβ(25-35) или растворителя. Было установлено, что общее число BrdU+-клеток в СВЗ у контрольных крыс при такой схеме введения было меньше, чем в предыдущей серии экспериментов, и на протяжении всего времени наблюдения не подвергалось существенному изменению. В то же время, через 6 дней после введения Аβ(25-35) число новых клеток было значительно увеличено. Число BrdU+-клеток не отличалось достоверно от контрольного уровня уже через 12 дней после операции, но все еще оставалось весьма высоким. Это также свидетельствует в пользу предположения о том, что Аβ(25-35) не только усиливает пролиферацию в СВЗ, но и снижает скорость миграции новых клеток по ростральному миграционному пути.

Иная картина изменений наблюдается при исследовании пролиферации и созревания клеток в СГЗ. Так, при субхроническом введении BrdU наблюдалось существенное снижение числа BrdU+-клеток в СГЗ ЗФ мозга крыс как через 6, так и через 12 дней после инъекции Аβ(25-35) по сравнению с контролем или пептидом Аβ(35-25). Тем не менее, при исследовании популяции «новых» клеток, образовавшихся через 1 день после операции, нам не удалось выявить каких-либо различий в числе BrdU—клеток ни на одном из исследованных сроков. В то же время, Аβ(25-35) существенно изменял характер созревания клеток. Так, через 28 дней после инъекции Aβ(25-35) доля BrdU-клеток, экспрессировавших маркер незрелых нейронов Dcx, была значительно выше в этой группе крыс по сравнению с контролем. Кроме того, доля BrdU-клеток, экспрессировавших маркер зрелых нейронов NeuN, была достоверно ниже по сравнению с контролем.

Для того чтобы понять, какие механизмы могут быть задействованы в опосредовании эффектов Аβ(25-35), необходимо кратко упомянуть об основных процессах, контролирующих нейрогенез. Наши представления об этих процессах в основном базируются на исследованиях механизмов деления клеток и экспрессии маркеров нейробластов. Стволовые клетки и предшественники делятся в специфическом микроокружении нейрогенной ниши. Нейроны ЗФ получают возбуждающую глутаматергическую иннервацию из энторинальной коры, а ГАМК-ергическая тормозная иннервация обеспечивается интернейронами самой ЗФ. Помимо этого нейроны ЗФ получают входы из разных отделов мозга, передача сигнала в которых опосредована различными медиаторными системами. Наиболее исследована роль глутамата и ГАМК в контроле деления и дифференцировки клеток в СГЗ ЗФ. Считается, что глутаматная трансмиссия, опосредованная NMDA-рецепторами, обратно коррелирует с уровнем пролиферации в гиппокампе. В то же время, сами нейробласты не экспрессируют NR1-субъединицу NMDA-peцепторов, играющую ведущую роль в нейротрансмиссии, однако эти клетки деполяризуются в ответ на аппликацию ГАМК, а, кроме того, ГАМК-ергическая стимуляция способствует дифференцировке гиппокампальных предшественников типа 2. По-видимому, ГАМК играет более выраженную роль в процессах пролиферации и дифференцировки новых клеток в СГЗ гиппокампа как в обычных условиях, так и в условиях патологии. Кроме того, пептидные нейромедиаторы также могут оказывать влияние на нейробласты СВЗ и СГЗ.

Нейральные стволовые клетки, подобно стволовым клеткам из других органов и тканей, экспрессируют рецепторы к большому набору ростовых факторов, что свидетельствует о возможной регуляции пролиферации этих клеток такими молекулами. На сегодняшний день получены свидетельства того, что практически все известные ростовые факторы в той или иной мере обладают способностью воздействовать на нейрогенез. Например, повышение уровня BDNF в нейрогенных областях приводит к усилению пролиферации предшественников. Установлено, что пролиферация клеток, взятых из субвентрикулярной области in vitro, требует наличия нескольких ростовых факторов. К их числу, наряду с уже упомянутым BDNF, относятся эпидермальный фактор роста (EGF) и основный фактор роста фибробластов (bFGF). Предполагается, что эти же ростовые факторы стимулируют нейрогенез in vivo.

Можно предположить, что отрицательное влияние Aβ на пролиферацию клеток связано с нарушением трофического обеспечения. Так, установлено, что агрегированный Aβ негативно влияет на уровень BDNF у трансгенных мышей. Введение Аβ(1-42) в мозг крыс также приводит к снижению содержания этого нейротрофина. С другой стороны, длительное введение Аβ(1-42), Аβ(1-40) или Аβ(25-35) приводило к увеличению экспрессии BDNF.

Клетки пролиферативных областей мозга могут находиться под влиянием и других внешних факторов, среди которых хотелось бы особо остановиться на воздействии свободных радикалов. ГАМК-ергические нейроны Аммонова рога и ЗФ могут служить источником NO. При этом оказывается, что области, богатые нитрергическими нейронами, анатомически тесно связаны с областями интенсивного нейрогенеза. Такое наблюдение справедливо как для гиппокампа, где нитрергические нейроны гранулярного слоя и хилуса находятся в непосредственной близости от пролиферирующих клеток СГЗ ЗФ, так и для СВЗ. Последняя богата аксонами нитрергических нейронов, образующими здесь густую сеть, в петлях которой расположены кластеры пролиферирующих нейробластов. Отростки нейронов, экспрессирующих nNOS, наблюдаются также и на всей протяженности рострального миграционного русла, где они тесно переплетаются с цепочками пролиферирующих и мигрирующих клеток. В самих нейробластах, мигрирующих от субвентрикулярной области, экспрессии nNOS не отмечается, и лишь в некоторых клетках, уже достигших гранулярного и перигломерулярного слоев обонятельной луковицы, начинает экспрессироваться nNOS. Указанные области обонятельной луковицы являются местами, где происходит дифференцировка нейральных предшественников, что, по мнению Е.Р. Матарредона и др., может говорить как о дифференцировке нейральных предшественников в нитрергические нейроны, так и о временной экспрессии nNOS в процессе дифференцировки нейронов. Все это позволяет задуматься о возможном участии нитрергических механизмов в регуляции процессов нейрогенеза не только на ранних этапах онтогенеза, но и в мозге взрослых животных. Также известно, что NO подавляет пролиферацию многих типов клеток in vitro, при этом блокируя пролиферативные эффекты некоторых ростовых факторов, в частности EGF. NO подавляет пролиферацию предшественников нейронов в СВЗ. При этом авторам не удалось наблюдать аналогичного эффекта в ЗФ. А. Ченг и др. установили, что система NO участвует в механизме действия BDNF на дифференцировку нейральных предшественников. В частности, было показано, что BDNF повышает экспрессию nNOS в предшественниках нейронов в СВЗ, останавливая их пролиферацию и запуская дифференцировку, а ингибирование nNOS блокирует дифференцирующее действие BDNF.

В настоящее время остается неясным, как на молекулярном уровне NO оказывает свое антипролиферативное и дифференцирующее действие. С.P Джеффри с соавторами полагают, что в качестве такого механизма выступает осуществляемое NO нитрозилирование -SH групп цистеиновых остатков различных рецепторных и регуляторных белков с образованием нитрозотиолов, что приводит к изменению активности белков-мишеней. В подтверждение этой концепции авторы работы показали, что NO может обратимо нитрозилировать рецептор EGF. Рецептор EGF представляет собой мембранную тирозинкиназу, димеризующуюся при связывании EGF и взаимно фосфорилирующуюся по остаткам тирозина. Воздействие NO приводит к ингибированию реакции фосфорилирования рецептора EGF, а также к замедлению пролиферации, вызванной EGF.

Можно предположить, что помимо NO и другие свободные радикалы и метаболиты окислительного стресса могут оказывать воздействие на обсуждаемые процессы. Например, аппликация Аβ(1-40) в культуру стволовых клеток человека приводила к увеличению в них содержания карбонильных групп в белках и продуктов ПОЛ. Окислительный стресс, вызванный радиоактивным облучением или экспозицией в атмосфере, обогащенной озоном, ведут к угнетению нейрогенеза. В пользу этого свидетельствует также подавление нейрогенеза в результате эмоционального стресса. Известно, что и острый, и хронический эмоциональный стресс сопровождаются изменениями свободнорадикального окисления и в ряде случаев повреждением нейронов гиппокампа. Возможно, что дополнительный негативный эффект стресса на нейрогенез связан с выбросом стрессорных гормонов в кровь. Косвенным свидетельством того, что свободные радикалы до определенной степени могут контролировать и/или изменять процессы пролиферации клеток в мозге, является ее усиление вследствие двигательной активности. Было показано, что умеренная физическая нагрузка повышает антиоксидантную защиту организма в целом и мозга в частности, и снижает вероятность возникновения БА. Таким образом, окислительный стресс, вызываемый в гиппокампе введением Аβ(25-35) в боковые желудочки, может быть одной из причин угнетения пролиферации и замедления дифференцировки в СГЗ ЗФ.