Лабораторная диагностика хламидиоза

Проводят индикацию хламидий непосредственно в пораженных клетках, выделение хламидий и обнаружение хламидийных антител.

Индикация хламидий непосредственно в пораженных клетках. Этот метод предусматривает выявление цитоплазматических включений, образуемых хламидиями, при окрашивании морфологических структур микроорганизма или его антигенов. Материалом служат соскобы с доступных слизистых оболочек мочеполовых органов (мочеиспускательный канал, шейка матки, канал шейки матки) и других органов (конъюнктива, прямая кишка и др.) при экстра генитальных формах хламидийной инфекции. Реже исследуют мазки — отпечатки выделений, секретов и тканей, биопсированных при хирургических вмешательствах.

Выявление морфологических структур микроорганизма. Обнаружение цитоплазматических включений хламидий в эпителиальных клетках препаратов, окрашенных по методу Романовского — Гимзы, является классическим методом диагностики хламидиозов,

Цитоплазматические включения представляют собой компактные или рыхло расположенные зернистые массы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах его размножения. Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают его к периферии клетки, имеют разнообразную, правильную или неправильную форму, отличаясь по цвету и внутренней структуре от ядра и цитоплазмы (рис. 82). Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца диаметром 0,5—1,2 мкм, имеют сине-фиолетовый цвет. Крупные включения, содержащие преимущественно мелкие зрелые структуры возбудителя, имеют розово-красный цвет. Часто в одной клетке выявляются включения хламидий разной зрелости и различной плотности расположения. Нередко при рыхлом расположении морфологических структур микроорганизма обнаруживается содержащая их вакуоль.

Во избежание диагностических ошибок цитоплазматические включения следует четко дифференцировать с другими структурными образованиями, которые могут встречаться в исследуемых препаратах. Это пигментные гранули черного или темно-зеленого цвета, иногда располагающиеся в цитоплазме у ядра в виде зернистых масс: зернистые структуры травмированного ядра, сходные по цвету, форме и размерам с ядерным материалом неповрежденных клеток; зерна муцина, окрашивающиеся в красный или синий цвет, располагающиеся в цитоплазме отдельно друг от друга; эозинофильные зерна разрушенных эозинофилов, располагающиеся одиночно или на поверхности эпителиальных клеток; диффузная эозинофильная многомерная зернистость цитоплазмы; клеточный детрит, адсорбированный на поверхности или фагоцитированный эпителиальной клеткой; сопутствующая микрофлора, включающая гонококки, стрептококки, пневмококки, дифтероиды и другие микроорганизмы, которые обычно выявляются не только на поверхности эпителиальных клеток, но и на других участках препарата.

Выявление цитоплазматических включений в препаратах из соскобов позволяет в целом диагностировать около 10—15 % случаев хламидийной инфекции, протекающей как манифестно, так и бессимптомно.

Выявление антигенов микроорганизма. Для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции используют метод флюоресцирующих антител, основанный на классических разработках Coons, Kaptan, который широко применяется при диагностике многих вирусных и бактериальных инфекций. Сущность его заключается в соединении антител, меченных флуорохромом, со специфическим антигеном и наблюдении продукта реакции под люминесцентным микроскопом.

Обнаружение цитоплазматических включений хламидий в эпителиальных клетках препаратов из соскобов с помощью флюоресцирующих антител является высокочувствительным и специфическим методом диагностики урогенитальной хламидийной инфекции. Во избежание диагностических ошибок нужно использовать реагенты высокого качества, обеспечить контроль и строгую оценку результатов.

Метод флюоресцирующих антител для выявления антигенов хламидий в цитоплазматических включениях можно использовать в прямой и непрямой модификациях. Метод прямой иммунофлюоресценции требует флюоресцирующей хламидийной антисыворотки, метод непрямой иммунофлюоресценции (НПФ) — сыворотки человека или животного, содержащей хламидийные антитела, и соответствующей антивидовой флюоресцирующей сыворотки, обычно промышленного выпуска. В тест-системе метода прямой иммунофлюоресценции, разработанного и апробированного для индикации хламидий в различных материалах, используют овечью хламидийную антисыворотку, меченную флюоресцеина изотиоцианатом, и для контрастирования фона препарат — бычий альбумин, меченный родамином, выпускаемый НИИЗМ им, Н.Ф. Гамалеи АМН России. При люминесцентной микроскопии антигены хламидий выявляются на темном или оранжевом (при контрастировании родамином) фоне цитоплазмы эпителиальных клеток в виде цитоплазматических включений флюоресцирующих ярко-зеленым или желтовато-зеленым цветом. Флюоресцирующие включения могут иметь гомогенную, зернистую или смешанную структуру. Специфическая флюоресценция может соответствовать или не соответствовать топографии цитоплазматических включений, а также выявляться в клетках, в которых не удается обнаруживать морфологические структуры хламидий при окраске по Романовскому — Гимзе.

Большая диагностическая информативность метода флюоресцирующих антител связана с тем, что с его помощью выявляются не только корпускулярные, но и растворимые антигены хламидий, его показатели меньше зависят от изменения тинкториальных свойств хламидий в процессе инфекции, особенно при этиотропной терапии и, наконец, с тем, что светящиеся антигены хламидий выявляются легко и быстро.

Диагностическое выделение хламидий. Диагноз заболевания доказывает выделение возбудителя. Используемые методы требуют специального оснащения и соответствующей квалификации персонала.

Диагностическое выделение хламидий при урогенитальной хламидийной инфекции проводят в эпителиальных клетках оболочек желточных мешков развивающихся куриных эмбрионов и в культуре клеток, наиболее широко используемой в настоящее время.

Важнейшие условия получения правильных результатов — надежное освобождение исследуемого материала от сопутствующей бактериальной флоры и предупреждение инактивации хламидий при транспортировке и хранении материала. Это достигается обработкой исследуемых образцов антибиотиками, не влияющими на жизнедеятельность хламидий и одновременно оказывающими бактерицидное действие на сопутствующую микрофлору, а также использованием транспортных сред, низких температур и максимальным сокращением сроков между сбором материала и его введением в куриные эмбрионы или в культуру клеток.

Хламидии лучше выявляются (особенно при заражении куриных эмбрионов) из интенсивно инфицированной) первичного материала, взятого у больных, не получавших антихламидий ной терапии. Тем не менее и при хронических формах хламидийной инфекции, а также при ее бессимптомном течении эти методы Дают ценную диагностическую информацию.

Выделение хламидий в куриных эмбрионах. Выделение хламидий в 6—8-дневных развивающихся куриных эмбрионах, зараженных в желточный мешок, долго был единственным методом надежной этиологической диагностики хламидийных инфекций и остается высокоспецифическим методом диагностики урогенитальной хламидийной инфекции, ее экстрагенитальных проявлений, а также венерической лимфогранулемы.

Этот метод по чувствительности близок методу диагностического выделения хламидий в культуре клеток и несколько уступает методу флюоресцирующих антител, используемому для выявления антигенов микроорганизма в инфицированных клетках.

Критериями диагностического выделения хламидий являются наличие морфологических структур микроорганизма и содержание родоспецифического антигена. Специфическая летальность эмбрионов обычно проявляется в последующих пассажах.

Рассматриваемый метод технически прост, но он трудоемкий и длительный (от 7—12 дней до 3—4 нед с учетом проведения 2—3 слепых пассажей), что ограничивает его практическое применение при наличии ускоренных методов этиологической диагностики инфекции. В то же время его широко используют при установлении хламидийной этиологии различной патологии, для получении лабораторных культур хламидий и в различных научных исследованиях.

Выделение хламидий в культурах клеток. Большинство представителей вида С. trachomatis, за исключением возбудителя венерической лимфогранулемы, не способны в стандартных условиях инфицировать клетки и размножаться в различных культурах клеток. Это обстоятельство долго ограничивало использование метода культур клеток для диагностики урогенитальных хламидиозов и хламидиозов другой локализации.

Избежать этого помогло использование дополнительных методических приемов, способствующих повышению адсорбции микроорганизма на поверхности клеток, активации его поглощения клеткой и подавлению ее нормального метаболизма. С этой целью широко применяют как самостоятельно, так и в различных комбинациях центрифугирование инфекционного материала на монослой клеток, облучение клеток рентгеновскими лучами, обработку монослоя клеток ДЕАЕ-декстраном — поликатионом, активирующим поглощение макромолекул, обработку клеток 5-йод-2-дезоксиуридином или циклогексимидом — антиметаболитами, обладающими цитостатическим действием.

В настоящее время для диагностического выделения хламидий из мочеполовых органов наиболее часто используют клетки McCoy-, HeLa-22 9 и L-929.

Обнаружение хламидийных антител. Для серодиагностики и изучения эпидемиологии урогенитальных и сходных с ними хламидиозов другой локализации в настоящее время используют два метода — общепринятую PCK с родоспепифическим антигеном (общим для С. trachomatis и С. psittaci) и микрометод реакции НИФ с типоспецифическими антигенами С. trachomatis. Реакция НИФ в различных модификациях находит все более широкое применение как. с целью серодиагностики хламидийной инфекции, так и для установления иммунотипов С. trachomatis, циркулирующих в регионе.

Благодаря исследованиям и практическим разработкам Э.С. Горовиц, О.А. Тимашевой налаживается промышленное производство сухих орнитозных диагноста кумов эритроцитарного для реакции непрямой гемагглютинации (PHГ) и диагностикума для иммунофлюоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА). Эти серологические реакции, безусловно, найдут широкое применение в серодиагностике не только орнитоза, но и других, хламидиозов. Высоких результатов выявления урогенитальной хламидийной инфекции следует ожидать при использовании типоспецифических антигенов С. trachomatis.

Одним из перспективных методов серодиагностики хламидиозов является и вариант иммуноферментного метода — микрометод ELISA, который оказался значительно более чувствительным? чем РСК, и конкурирует с микрометодом НИФ при орнитозе и хламидийном уретрите.