Лабораторная диагностика сифилиса

Микроскопическое исследование. При первичном сифилисе нa бледную трепонему исследуют отделяемое шанкров или пунктат регионарных лимфатических узлов, при вторичном сифилисе — материал из различных поражений кожи и слизистых оболочек.

Материал для исследования получают от больного до лечения непосредственно в лаборатории. Для получения материала поверхность язвы протирают ватой, смоченной стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, затем дно язвы слегка раздражают платиновой лопаточкой, предварительно прокаленной на огне и охлажденной. Для большого выделения тканевой жидкости пальцами в резиновой перчатке сдавливают плотное основание язвы.

Исследуемую тканевую жидкость вносят лопаточкой в каплю изотонического раствора хлорида натрия на предметном стекле, смешивают, накрывают покровным стеклом и исследуют в оптическом микроскопе с темнопольным конденсатором, объективном 40, окуляром 7х, 10х или 15х. Между линзой конденсора и предметным стеклом должна быть капля дистиллированной воды.

Пунктат из лимфатического узла получают в асептических условиях при помощи шприца с толстой иглой, содержащего несколько капель изотонического раствора хлорида натрия. Фиксируя иглу пальцами в лимфатическом узле, ее слегка раскачивают для разрушения окружающей ткани, вводят имеющийся в шприце изотонический раствор хлорида натрия, а затем отсасывают материал для исследования.

Если исследование производят не тотчас, то материал в запаянном капилляре помещают в термостат для сохранения подвижности трепонем. В таком виде его можно пересылать и в другие лаборатории, так как жизнеспособность трепонем в указанных условиях может сохраняться до 1—2 нед. Для более длительного сохранения используют консервирующий раствор, состоящий из 10 мл 40% формалина и 90 мл фосфатного буфера (88 мл 1/15 М фосфата натрия и 12 мл 1/15 M фосфата калия). При этом трепонемы сохраняют свои морфологические особенности и могут быть обнаружены в нативном или окрашенном препарате.

Обработка препарата по способу Бурри. На предметном стекле смешивают каплю исследуемого материала с каплей специальной (китайской) туши, разведенной пополам дистиллированной водой. Делают тонкий равномерный мазок, высушивают и исследуют в микроскопе с иммерсионной системой. В настоящее время данным способом практически не пользуются.

Окраска по способу Романовского — Гимзы. обсушенный препарат фиксируют 3—5 мин в метиловом или этиловом спирте, окрашивают в течение 2—24 ч раствором краски Гимзы (1 капля на 1 мл дистиллированной воды).

Окраска по способу Фонтана. Сухой нефиксированный мазок опускают на 1—5 мин в стакан с жидкостью Pyге следующего состава: ледяная уксусная кислота — 1 мл, раствор формалина 40 % — 20 мл, дистиллированная вода — 100 мл. После промывания на препарат наливают раствор, служащий протравой: танин — 5 г, дистиллированная вода — 80 мл, раствор карболовой кислоты 5% — 20 мл.

Стекло с препаратом нагревают до появления паров, после чего раствор оставляют еще на 30 с и промывают препарат в проточной воде. Затем производят серебрение с подогреванием на пламени до появления паров, оставляют раствор на препарате еще на 30 с, промывают водой и высушивают.

Для серебрения применяют раствор следующего состава: нитрат серебра — 1 г, дистиллированная вода — 400 мл. После растворения серебра по каплям добавляют раствор аммиака, в результате чего появляется коричневый осадок. Раствор аммиака добавляют до исчезновения осадка и появления опалесценции раствора.

Окраска по способу Морозова в принципе аналогична описанной выше, при изготовлении растворов используется лишь другое соотношение веществ.

При микроскопическом исследовании бледные трепонемы имеют вид тонкой спирали с истонченными концевыми отделами. Длина трепонемы 8—12 мкм, ширина 0,25 мкм, имеется в среднем около 10 завитков, расстояние между которыми около 1 мкм. Завитки в середине тела расположены теснее, чем на концах. В темном поле зрения можно наблюдать поступательное вращение трепонемы вокруг оси, скользящее взад и вперед, сгибание тела в стороны. По Романовскому — Гимзе она окрашивается в нежно-розовый цвет. При обработке препаратов по способу Бурри неокрашенные трепонемы хорошо видны на темном фоне, В мазках, окрашенных по Фонтану и Морозову, они коричневого цвета.

При исследовании материала на бледную трепонему нужно учитывать возможность обнаружения в нем несифилитических трепонем. В язвах и мокнущих папулах на гениталиях могут быть Tr. calligurum, отличающиеся большей длиной и толщиной, а так-более мелкие Тr. genitalis, которые интенсивно окрашиваются способу Романовского — Гимзы. Еще крупнее Тг. refringens. Более трудно распознавание Tr. microdentium, Tr. macrodentium и других, обитающих в зеве и ротоглотке, которые по морфологическим свойствам ближе к бледной трепонеме.

Серологическая диагностика. В 1985 г. Министерством здравоохранения России утверждена «Инструкция по постановке серологических реакций на сифилис», согласно которой в состав комплексa серологических реакций (KCP), предназначенного для диагностики данного заболевания, входит PCK с трепонемным и кардиолипиновым антигенами, а также микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном. Кроме того, микрореакция изолированно используется в качестве отборочного теста на сифилис. Инструкция предусматривает применение для серодиагностики сифилиса и для распознавания биологически ложноположительных результатов, полученных в тестах с липоидными антигенами, и РИБТ, и РИФ в различных модификациях.

В связи с тем что каждая реакция имеет свою специфику, профилактическое обследование населения на сифилис рекомендуется проводить с помощью микрореакции или КСР, причем доноры и беременные, включая направляемых на искусственное прерывание беременности, а также больные психиатрических и неврологических стационаров должны обследоваться только с использованием КСР, что обусловлено более высокой чувствительностью реакции связывания комплемента с трепонемным антигеном по сравнению с липоидными тестами при поздних формах сифилиса.

Реакция связывания комплемента (РСК). В 1901 г. французские ученые Bordet и Gengon разработали реакцию связывания комплемента, в основу которой положили феномены бактериолизиса и гемолиза, причем гемолитическая система являлась индикатором процесса, происходящего между основными антигеном и антителом.

В 1906 г. Wassermann, Neisser, Bruck использовали принцип этой реакции для серодиагностики сифилиса, взяв в качестве антингена печень пораженного сифилисом плода, в связи с чем авторы считали этот тест специфическим. Однако вскоре другие исследователи показали, что положительный результат PCK может быть получен и со спиртовыми вытяжками из органов не зараженных сифилисом животных. В то же время Klopstock, исследуя сыворотки крови кроликов, иммунизированных культурой бледных трепонем, доказал выработку у них противотрепонемных антител и более высокую чувствительность трепонемного антигена по сравнению с липоидным.

До настоящего времени параллельно изучаются и совершенствуются трепонемные и липоидные антигены для PCK при сифилисе.

Изучение трепонемных антигенов в серодиагностике сифилиса было поставлено ка более высокий уровень работами Alessandro и соавт. и Portnoy, Magnuson, использовавших в качестве антигенов для PCK фракции из культуральных и патогенных бледных трепонем. За рубежом на большом клиническом материале была применена эта реакция,

В России детальное изучение антигенов из патогенных и культуральных трепонем проведено Л.В. Сазоновой, показавшей несколько более высокую чувствительность ультраозвученного трепонемного антигена по сравнению с протеиновой фракцией культуральных бледных трепонем при поздних формах сифилиса, но протеиновая фракция более специфична. Автор установил также близкую диагностическую ценность PCK с протеиновой фракцией патогенных и культуральных бледных трепонем (99,4 % совпадающих результатов), что обусловливает целесообразность использования в серологических тестах на сифилис антигенных препаратов из культуральных трепонем, более простых в изготовлении и экономичных. Работы В.О. Поварской показали возможность дальнейшего совершенствования трепонемного антигена для РСК. Методом баллистической дезинтеграции с последующим дифференциальным центрифугированием и осаждением абсолютным этиловым спиртом она получила фракции клеточных стенок, цитоплазматических мембран и цитоплазмы культуральных бледных трепонем и показала наибольшую антигенную активность в PCK клеточных стенок.

Параллельно совершенствованию трепонемного антигена модифицировался и липоидный антиген. Крупным достижением была разработка в 1947 г. Pangborn кардиолипинового антигена, который в нашей стране по оригинальной методике изготовила Л.C. Резникова. В настоящее время кардиолипиновый антиген является международным стандартом и внесен в Международную фармакопею. За истекшие годы большое число отечественных и зарубежных авторов дали высокую оценку этому антигену,

В 50-е и последующие годы большое значение для развития отечественной серологии имели работы Н.М. Овчинникова и его учеников. Разработка методик постановки и изучение таких Специфических реакций на сифилис, как РИТ, РИФ, РИП, широко проводились в различных лабораториях страны. Большое внимание Н.М. Овчинников уделил совершенствованию антигена для РСК, разработке отборочного теста на сифилис, организации серологической службы и унификации серодиагностики сифилиса в России.

В 1959 г. Н.М. Овчинников, Л.С. Резникова, Е.Т. Супрун рекомендовали использовать для PCK ультраозвученный трепонемный антиген из культуральных бледных трепонем, который в дальнейшем стал изготавливаться производственным путем и сегодня обязательно используется в PCK на сифилис. Озвученный трепонемный антиген высоко оценили Pantrizel и соавт., Vaisman, Hamelin и другие, но большее применение за рубежом нашла PCK с протеиновой фракцией из паточных или культуральных бледных трепонем штамма Рейтера (TPCF, RPCF).

Особое место среди отечественных исследователей, изучавших возбудитель сифилиса, принадлежит Р.Р. Гельтцеру и его школе. В 1922—1926 гг. впервые в нашей стране он выделил из мок-папул больных сифилисом два штамма бледных трепонем, обозначенных I и II «Казань», Штаммы IV и V «Казань» изолированы в 1940 г. З.X. Каримовой, ГГ. Кондратьевым, а VI, VII, VIII и IX «Ставрополь» — в 1946 г. Л.И. Тутовой из крови больных вторичным сифилисом. Р. Р. Гельтцер разработал питательные среды для культивирования бледной трепонемы и изучил условия поддержания штаммов в лаборатории, что oбecпечило сохранение их до настоящего времени и использование для производственного изготовления ультраозвученного трепонемного антигена для РСК.

Изучение Р.Р. Гельтдером, О.П. Крыловой, З.С. Леперт, Л.В. Зебницкой и другими антигенных свойств вышеуказанных штаммов позволило подразделить их на 3 группы, что учитывается при изготовлении ультраозвученного трепонемного антигена для РСК.

О.П. Крылова при PCK установила наиболее выраженные антигенные свойства у VIII штамма культуральных бледных трепонем.

В 1933 г, Р.Р. Гельтцер предложил использовать в качестве антигена для PCK алкоголизированную взвесь культуральных бледных трепонем. В связи с тем что при поздних формах сифилиса бледная трепонема в организме больных в основном находится в атипичной форме, Р.Р. Гельтцер большое внимание уделил гранулярным формам возбудителя сифилиса. В.Н. Беднова показала возможность образования зернистых форм культуральных бледных трепонем под действием различных физических и химических факторов и развитие типичных извитых форм из гранулярных при создании благоприятных условий. О.А. Вереютина установила при нейросифилисе большую чувствительность PCK с использованием антигена из атипичных форм культуральных бледных трепонем (92,1 %) по сравнению с трепонемным (84,3%) и кардиолипиновым (63%) антигенами.

Много лет исследователи подбирали оптимальные условия для РСК, В настоящее время в серологической практике реакцию довольно широко ставит на холоде, со сменой температурных режимов. В 1926 г. Kolmer предложил наиболее ценную модификацию РСК, при которой связывание антигена с антителом проходит при комнатной температуре, соединение комплекса антиген — антитело с комплементом — при 6—8 °C, период после добавки гемолитической системы — при 38 °С.

В России эту реакцию наиболее полно изучали Л.С. Резникова, О.А. Стоянова. В результате исследования 21 257 сывороток крови они установили высокую чувствительность данного теста при всех формах сифилиса, особенно при сифилисе первичном и скрытом. При исследовании 16480 сывороток крови больных с кожными заболеваниями, лепрой, злокачественными новообразованиями и других контингентов было получено лишь 0,04—0,33 % неспецифических результатов.

В 1942 г. Kolmer предложил методику PCK с уменьшенным объемом ингредиентов (1/5). Эта модификация сохранила ценность до настоящего времени, как и PCK с уменьшающимися объемами исследуемой сыворотки крови, которую рекомендовал eще в 1909 г. Boas.

Определенным этапом в развитии классической серодиагностики сифилиса была разработка простых и экономичных активных модификаций РСК, родоначальником которых был Н.A. Черногубов. Из модификаций этого метода в России наибольшее применение имели реакции Григорьева — Рапопорта, Вайнштейна — Резниковой, Нарциссова и др. Эти реакции можно ставить в недостаточно оборудованных лабораториях, в экспедициях и пр. Основные их особенности заключаются в использовании естественного комплемента и гемолизина сыворотки крови, обследуемого на сифилис, применение гемолитического индекса, введение в реакцию гемолитической сыворотки против эритроцитов человека, а также эритроцитов морской свинки вместо бараньих. Однако указанные особенности реакций обусловливают и недостатки метода, так как не все сыворотки крови обладают выраженной гемолитической способностью, дети в первые недели после рождения нe имеют в крови комплемента, при хранении сывороток крови более 24 ч в них снижается титр гемолизина, что повышает процент неспецифических результатов. Все это ограничило использование активных модификаций РСК.

Ввиду широкого применения PCK для диагностики многих инфекционных заболеваний представляют интерес исследования, направленные на удешевление данного теста. Дорогостоящим и дефицитным является комплемент морской свинки, в связи с чем много лет изучали возможность его замены сывороткой крови других животных, но было установлено, что сыворотка крови крупных домашних животных содержит мало комплемента. Было показано также, что в сыворотке крови людей наблюдается индивидуальное колебание количества комплемента. Л.С. Резникова в 1938—1945 гг. изучала в PCK комплемент человека и показала возможность его использования в виде смеси свежих активных сывороток крови. Она разработала способ консервации комплемента человека и методику PCK на сифилис с этим комплементом. Это исследование имело большое значение для отечественного здравоохранения в период Великой Отечественной войны и в послевоенные годы, так как обеспечивало возможность обследования сифилис больших групп населения. Аналогичным качеством обладал и комплексный комплемент, предложенный в 1942 г. С.И. Гинзбург и В.С. Калининым. Однако в дальнейшем вернулись к сыворотке крови морской свинки при PCK как к наиболее стабильному комплементу. В 1986 г. Н.К. Гусейнов на большом материале изучил активность комплемента сыворотки крови домашних свиней и сообщил о возможности его использования в качестве резервного реагента для РСК.

Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР, KPR, VDRL, USR, ART и др.). С 1927 г. за рубежом стали более широко изучать микрореакции с антигеном в виде спиртового экстракта из органов здоровых животных. Однако на другой уровень были подняты эти исследования после того, как Pangborn и соавт. разработали кар. диолипиновый антиген. С этим антигеном был предложен ряд тестов: VDRL — с инактивированной сывороткой крови, RPR — с плазмой крови, USR — с активной сывороткой крови, ART — автоматизированный реагин-тест и др.

В России наиболее оригинальные методики микрореакции предложили М.М. Израильсон, С.Л. Ширвиндт. В 1953 г. Л.С. Резникова, Т.И. Пак создали универсальный антиген для РСК, осадочных реакций и микрореакции, который обеспечивал более высокую чувствительность микрореакции, но не был стандартизован.

Разработав в 1955 г. отечественный кардиолипиновый антиген, Л.С. Резникова изучила его в микрореакции с положительным результатом. В последующие годы широко изучалась микрореакция с кардиолипиновым антигеном производственного приготовления, она нашла широкое применение как отборочный тест на сифилис.

Проведенные в ЦКВИ исследования показали, что чувствительность микрореакции близка к чувствительности PCK с кардиолипиновым антигеном при всех формах сифилиса как до специфического лечения, так и после его окончания. В.И. Беднова, Т.И. Милонова при обследовании 541 больного с разными стадиями заболевания до и в процессе лечения получили положительные результаты микрореакции в 94 %, a PCK с кардиолипиновым антигеном — в 92,9% случаев. В настоящее время в сочетании с PCK микрореакция с инактивированной сывороткой крови включена в КСР.

Методика микрореакции заключается в следующем.

Необходимые для реакции реактивы: антиген кардиолипиновый для микрореакцни; 70 % раствор холин-хлорида; натрия хлорид х. ч.; цитрат натрия трехзамещенный (Na3C6H5O7*5H2O): мертиолат (G9H9O2SNaHg); раствор хлорида натрия 0,9%.

10 % раствор холин-хлорида готовится следующим образом: к 29,65 мл изотонического раствора хлорида натрия добавляют 0,35 мл 0,01 % раствора мертиолата и 5 мл 70 % раствора холин-хлорида. Смесь тщательно перемешивают. При отсутствии мертиолата для приготовления 10 % раствора холин-хлорида необходимо к 30 мл изотонического раствора хлорида натрия добавить 5 мл 70 % раствора холин-хлорида. Раствор стойкий, при отсутствий бактериального загрязнения может храниться 10—12 мес при 4 °С.

5 % раствор трехзамещенного цитрата натрия готовится дистиллированной воде и фильтруется. Раствор нестоек. При мутнении его надо заменять свежим. Хранится в холодильник при 4 °C в течение 5—6 дней.

Контрольные лиофилизированные сыворотки крови. Отрицательную и положительную сыворотки крови используют неразделенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена, В день постановки реакции положительную сыворотку крови титруют на пластинке для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня в качестве контроля.

Титрование проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 3 капли изотонического раствора хлорида натрия и добавляют в первую и вторую лунки по 3 капли положительной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пастеровской пипеткой, насасывая и выпуская его в лунку 5—6 раз. Затем набирают часть содержимого второй лунки в пастеровскую пипетку и 3 капли переносят в третью лунку, а оставшуюся в пипетке сыворотку крови возвращают во вторую лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и 3 капли переносят в четвертую лунку к так далее до последней лунки. Из последней лунки 3 капли удаляют. Во все лунки добавляют по одной капле эмульсии кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают ручным способом или в аппарате для встряхивания в течение 5 мин, добавляют по 3 капли изотонического раствора хлорида натрия и оставляют при комнатной температуре на 5 мин, после чего регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (4-/2 + ), используют в качестве слабоположительного контроля. Для его получения делают соответствующее разведение.

При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения равномерно уменьшается величина хлопьев преципитата.

При снижении реактивности хранящейся контрольной сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови можно использовать до тех пор, пока она дает положительный результат (4+) в разведении не ниже чем 1:2, и слабоположительный результат (2+) в разведении не меньше чем 1:4, При дальнейшем снижении реактивности употребляющуюся положительную контрольную сыворотку крови заменяют новой.

При хранении контрольных сывороток крови не допускаются повторные замораживания и оттаивания, так как в этом случае реактивность снижается.

О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не эмульсии антигена судят по параллельному титрованию этой сыворотки крови с использованием хранившейся и вновь приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител в микрореакции с обеими антигенными эмульсиями, то считают, что снижение реактивности зависит от хранения контроль-сыворотки крови, если же снижение реактивности наблюдают только при использовании хранившейся эмульсии антигена, то это обусловлено снижением реактивности эмульсии антигена, которую необходимо заменить свежеприготовленной,

Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации.

Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность антигена в ампулах, При выпадении кристаллов холестерина их растворяют нагреванием ампул в термостате или водяной бане при 37 °C или 56 °C соответственно.

Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают количество, необходимое на рабочий день или рабочую неделю (на 50 исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена), В пробирку вносят сухой пипеткой не более 2 мл антигена, добавляя его к равному объему изотонического раствора хлорида натрия, перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 мин, затем центрифугируют при 1000 об/мин до получения прозрачной над-осадочной жидкости. Жидкость удаляют, а к осадку добавляют 3,5 объема (по отношению к взятому антигену) 10 % раствора холин-хлорида. Пробирку плотно закрывают пробкой и содержимое взбалтывают, опрокидывая пробирку, до полного ресуспендирования. Полученная эмульсия готова к употреблению. Большое количество эмульсии готовят не в одном флаконе большой вместимости, а в нескольких пробирках, внося в каждую по 2 мл антигена.

Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4 °C нe более недели, а при добавлении раствора мертиолата — в течение 2 нед. В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 мин и проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови. Проверяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой серии антигена проверяют экспресс-методом одновременно с уже бывшей в работе серией на положительных и отрицательных сыворотках крови. О пригодности антигена судят по величине титров, наблюдаемых при одновременном титровании положительных сывороток крови с новой и проверенной сериями антигенов. Получение близких результатов, т. е. титров реагинов, отличающихся на ±1 разведение, хлопьев преципитата одинаковой выраженности, наблюдаемых в одних и тех же разведениях положительных сывороток крови, а также отсутствие преципитата в отрицательной сыворотке крови свидетельствуют о пригодности исследуемой серии антигена. Серию антигена бракуют, если одновременное титpoвание контрольной положительной сыворотки крови с новой серией антигена показывает: а) слабовыраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях сыворотки крови; б) более низкий (на 2—3 разведения) титр реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией; в) присутствие преципитата в отрицательных сыворотках крови.

Получение плазмы крови. Кровь берут из пальца так же, как для исследования СОЭ, Капилляр аппарата Панченкова смачивают 5 % раствором цитрата натрия и набирают раствор до метки «К», возвращают раствор во флакон до метки «25», а оставшийся цитрат выливают в центрифужную пробирку, куда затем вносят 3 капиллярные пипетки крови, взятой до метки «К», перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы, которую отсасывают пастеровской пипеткой для проведения исследования.

Получение инактивированной сыворотки крови. Кровь берут из вены, получают сыворотку крови и инактивируют ее так же, как для РСК.

Методика микрореакции с плазмой и инактивированной сывороткой крови. Пастеровской пипеткой берут плазму или инактивированную сыворотку крови и вносят по 3 капли в лунки, куда затем добавляют по одной капле эмульсии кардиолипинового антигена. Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины в течение 5 мин, после чего в каждую лунку добавляют по 3 капли изотонического раствора хлорида натрия, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 мин (оптимальный температурный режим 23—28 °C). Результаты учитывают только после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке.

Оценка результатов реакции. Результаты учитывают невооруженным глазом над искусственным источником освещения. В лунках с плазмой или сывороткой крови, взятой от больных сифилисом, выпадают хлопья различной величины. Появление крупных хлопьев расценивают как положительный результат (4+, 3+), средней величины и мелких — как слабоположительный результат (2+, 1+). В сомнительных случаях (±) надо ориентироваться на контроль (отрицательная сыворотка крови).

Количественная методика микрореакции. В 9 лунок горизонтального ряда пластин, начиная со второй лунки, вносят по 3 капли изотонического раствора хлорида натрия и добавляют в первую и вторую лунки по 3 капли исследуемой сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пастеровской пипеткой, набирая его в пипетку и выпуская в лунку 5—6 раз, затем часть содержимого набирают в пипетку и 3 капли переносят в третью лунку, а оставшееся в пипетке возвращают во вторую лунку. Из третьей лунки 3 капли переносят в четвертую и так повторяют до десятой лунки, из которой 3 капли удаляют. Таким образом, получают двукратные разведения сыворотки крови 1:2, 1:4, 1:8 и далее до 1:516. в первую лунку изотонический раствор не приливают, а вносят толькo 3 капли сыворотки крови, т. е. исследуют цельную сыворотку крови. Во все лунки добавляют по одной капле эмульсии кардиолипинового антигена. Пластину встряхивают 5 мин, после

чего во все лунки вносят по 3 капли изотонического раствора хлорида натрия. Через 5 мин регистрируют результаты.

Источники ошибок. Неправильное хранение антигена и сывороток крови, их бактериальное загрязнение, исключение из реакции контрольных сывороток крови, в частности слабоположительной, неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием, применение загрязненных пипеток, пробирок, панелей, растворов.

Целесообразно внедрение количественной методики микрореакции вместо количественной методики PCK с кардиолип и новым антигеном при контроле за эффективностью лечения больных сифилисом, так как это позволяет экономить время и ингредиенты, снижает стоимость серологического обследования больных сифилисом в процессе лечения.

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ, TPI — Treponema pallidum immunobifoation). В 1906 г. Hoffman и в 1907 г. Д.К. Зоболотный и П.П. Маслаковец впервые отметили уменьшение подвижности бледных трепонем под влиянием сыворотки крови больных сифилисом и оценили это явление как специфическое. На протяжении последующих лет этот феномен подтвердили ряд исследователей. В 1939 г. Turner и в 1948 г. Turner и соавт. описали защитную роль специфических антител, подавляющих развитие сифилитических поражений в эксперименте либо удлиняющих инкубационный период и уменьшающих проявления инфекции.

Nelson в результате изучения факторов, влияющих на выживаемость трепонем in vitro, разработал методику сохранения бледных трепонем жизнеспособными и подвижными в течение нескольких дней. В 1949 г. Nelson, Mayer описали новый серологический тест — реакцию иммобилизации бледных трепонем для обнаружения специфических антител в организме больных сифилисом. Суть этой реакции заключается в потере бледными трепонемами подвижности в присутствии иммобилизующих противопотрепонемных антител исследуемой сыворотки крови и комплемента в условиях анаэробиоза.

Этапы реакции: кролика заражают патогенными бледными трепонемами в яичко. При развитии специфического орхита (через 7—8 дней) удаляют яичко и получают из него взвесь бледных трепонем, которые служат антигеном в реакции. По определенной методике их соединяют с исследуемой сывороткой крови и комплементом (сыворотка крови морской свинки) в специальной среде и выдерживают в анаэробных условиях при 35 °C. В связи с тем что для получения феномена иммобилизации необходим комплемент, каждая используемая сыворотка крови исследуется в двух пробирках — с активным комплементов (опыт) и с комплементом, разрушенным нагреванием (контроль).

Через 18—20 ч результаты реакции учитывают при помощи оптической микроскопии с темнопольным конденсором. этом сравнивают процент подвижных трепонем в пробирке, содержащей исследуемую сыворотку крови и активный комплемент, и в пробирке с инактивированным комплементом. В контрольных пробирках 90 % трепонем остаются подвижными, в опытных число подвижных трепонем зависит от отсутствия или наличия специфических антител и их концентрации.

Основным условием правильного проведения реакции является получение из яичек взвеси бледных трепонем, свободных от специфических антител. Для этого в реакцию берут трепонемы на стадии раннего орхита у кролика и подавляют антителообразование путем введения кролику гидрокортизона после заражения, При РИТ комплекс антиген — антитело образуется в анаэробных условиях при замене воздуха газовой смесью, состоящей из 95% азота и 5% углекислого газа. Условия анаэробиоза должны быть строгими, так как содержание в газовой смеси 0,04% кислорода уже оказывает токсическое действие на трепонемы.

В процессе РИТ необходимо учитывать следующие моменты. Реакция должна проходить при температуре 35 °C, кроликов содержат в виварии при температуре не выше 18—20 °C. Животным нужны витаминизированные корма, не содержащие антибиотиков. Кролики должны быть свободны от спонтанного трепонематоза. Особое внимание следует обращать на чистоту лабораторной посуды, отсутствие бактериального загрязнения исследуемых сывороток крови, комплемента, среды выживания. В реакцию нужно вводить достаточное количество комплемента.

Hederstedt доказал наличие в активной сыворотке крови здоровых людей термолабильных субстанций, ведущих к неспецифической иммобилизации патогенных бледных трепонем. Косвенным подтверждением этого положения были наблюдения многих исследователей, осуществляющих РИТ, которые не получали ранних орхитов у ряда зараженных сифилисом кроликов.

Из отечественных авторов наиболее обширные исследования по этому вопросу провел Н.К. Гусейнов, который установил, что приблизительно у 20 % кроликов имеется неспецифическая иммобилизирующая активность сывороток крови, и разработал методику отбора кроликов для заражения с целью получения качественного антигена для РИТ.

Методика РИТ изложена в соответствующей инструкции.

В 50-е годы за рубежом в основном с целью определения воспроизводимости теста изучали количественную методику РИТ. В 60-е годы этот вопрос нашел отражение в работах отечественныx авторов. Наиболее полно его изучили Л.В. Сазонова, А.Г. Элоян. Они использовали трехступенчатые разведения исследуемых сывороток крови и показали возможность дифференциальной диагностики сифилиса скрытого раннего и позднего по титрам иммобилизинов. Большое внимание авторы уделили определению концентрации иммобилизинов в динамике в сыворотке крови леченых больных во время клинико-серологического контроля. Этот метод может дать положительные данные для решения вопроса об излеченности больных.

Для более широкого внедрения РИТ в практику серологических лабораторий Н.М. Овчинников разработал меланжерную методику реакции, при которой анаэробные условия создаются помещением реагирующей смеси в меланжер (лейкоцитарный смеситель) и закрытием его концов резиновым кольцом. Меланжерная методика позволяет осуществлять реакцию без вакуумного насоса, баллона со смесью азота и углекислого газа, микроанаэростата. В ряде лабораторий на большом клиническом материале меланжерная методика дала результаты, не уступающие классической анаэростатной методике,

В связи со сложностью методики РИТ и приготовления среды выживания для бледных трепонем в первые годы после ее описания разными авторами были получены противоречивые данные в отношении ее диагностической ценности. Однако за короткий промежуток времени стало ясно, что предложен тест, создавший эпоху в серодиагностике сифилиса.

В России уже в первых работах отечественных авторов были затронуты актуальные вопросы этой реакции, которые в дальнейшем были детально разработаны. Углубленное изучение РИТ в течение ряда лет проводилось под руководством H.М. Овчинникова.

За более чем 35-летний период применения РИТ во всем мире широко изучена ее диагностическая ценность и она единодушно признана самым специфичным тестом на сифилис. Однако ее применение все больше ограничивается из-за необходимости содержания кроликов в виварии, сложности проведения реакции и учета результатов высокой стоимости исследований.

Все чаще ее используют как тест-арбитр при оценке результатов других специфических тестов на сифилис. Сегодня ее основное значение заключается в диагностике скрытых и поздних форм заболевания и распознавании биологически ложноположительных результатов липоидных тестов на сифилис. Однако следует учитывать, что и при поздних формах заболевания РИТ может быть отрицательной, что в ряде случаев объясняется не отсутствием в крови иммобилизинов, а низкой их концентрацией. Это подтверждается результатами работ Л.В. Сазоновой, Л.Д. Берзиной, ставивших реакцию с увеличенным объемом исследуемой сыворотки крови.

При ликвородиагностике сифилиса РИТ не имеет ведущего значения; она чувствительнее РСК, но значительно уступает РИФ-ц, специфичность которой исключительно высока.

Реакция иммунного прилипания (РИП, TPIA — Treponema pallida immunoadherence). Основана на использовании феномена, который в 1912 г. описал Rieckenberg. Наиболее широко применительно к серодиагностике сифилиса этот тест изучался отечественными и зарубежными авторами в 50—60-е годы. Данные о ценности РИП как диагностического теста были противоречивы. В России обширные исследования провела Л.В. Сазонова, которая получила близкие результаты в РИП и РИТ при использовании свежеприготовленной взвеси патогенных бледных трепонем штамма Никольса. Однако применение прогретого или консервированного фенолом антигена резко искажало результаты реакции и делало антиген нестабильным. Рекомендовать данный тест для замены РИТ Л.В. Сазонова сочла невозможным.

Г.П. Авдеева, применив при изготовлении антигена другие температурный и временной режимы, получила при изучении РИП иные результаты. По ее данным, чувствительность этой реакции выше чувствительности KCP и РИТ, но несколько уступает РИФ, а специфичность РИП, РИТ и РИФ близка,

Однако отсутствие производственного выпуска антигена для РИП не позволило более широко изучить этот тест и внедрить его в практику.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, FTA-test-Fluorcscent treponemal antibody lest). В 1954 г. Weller, Coons разработали непрямой метод флюоресцирующих антител, который в дальнейшем нашел широкое применение в различных областях биологии и медицины. В 1957 г. Deacon, Falcone, Harris применили его для выявления противотрепонемных антител, а в 1959 г. Borel и Durel первыми использовали в клинической практике для серодиагностики сифилиса,

Суть реакции при выявлении специфических антител заключается в том, что соответствующий известный антиген фиксируется на предметном стекле» в первой фазе реакции на него наносят исследуемую сыворотку крови. При наличии в ней специфических антител образуется комплекс антиген — антитело, который при промывке препарата не удаляется, так как антиген фиксирован на стекле. Во второй фазе реакции препарат обрабатывают антивидовой люминесцирующей сывороткой, меченые антитела которой соединяются с комплексом антиген — антитело при условии его образования в первой фазе реакции. После промывши, высушивания и монтирования препараты исследуют в люминесцентном микроскопе, так как антивидовую сыворотку метят флюорохромом. Свечение антигена указывает на положительный результат реакции, при отсутствии специфических антител в Исследуемом материале свечения антигена не должно быть. По степени свечения антигена судят о количестве антител.

Разработан ряд модификаций РИФ, каждая из которых имеет свoe назначение. Первые исследования были посвящены оптимальному разведению сыворотки крови для реакции, обеспечивающему ее высокую чувствительность и специфичность. В результате изучения этого вопроса был предложен тест РИФ-200. Особенно широкое распространение эта модификация получила в нашей стране.

При исследовании 1098 сывороток крови людей, имевших половой контакт с больными сифилисом, леченых и нелеченых больных с различными формами сифилиса и «проблемных» сывороток крови, позитивных в РИТ, мы получили данные, указывающие на высокую чувствительность РИФ-200 при всех формах сифилиса. Особая ее ценность отмечена при диагностике в ранние периоды заболевания, когда другие серологические тесты еще отрицательны, а также при выявлении больных со скрытыми и поздними формами сифилиса при отрицательных результатах РИТ.

Высокую специфичность РИФ-200 продемонстрировали данные, зарегистрированные при исследовании 875 «проблемных» сывороток крови, негативных по РИТ. Отмечено только 0,34 % неспецифических положительных результатов, тогда как в KCP их процент колебался от 13,7 до 20,3 по различным тестам.

В 1964 г. Hunter, Deacon, Meyer предложили для снятия неспецифического свечения трепонем при РИФ использовать связывание групповых антител соникатом — ультраозвученной взвесью культуральных бледных трепонем штамма Рейтера.

Предложенная ими методика постановки РИФ-абс обеспечивала большую чувствительность теста в результате разведения исследуемых сывороток крови только в 5 раз и специфичность путем нейтрализации сорбентом групповых антител. В нашей стране методика РИФ-абс с отечественными ингредиентами разработана Л.Г. Хантке и Э.А. Орлиной.

Н.М. Овчинников и соавт., В.Н. Беднова, С.М. Воробенчик, Lesinska-Manikowska, Vaisman и соавт. и другие авторы показали возможность исследования в РИФ высушенной капиллярной крови и сыворотки крови, что позволяет исследовать образцы в далеко расположенных серологических лабораториях, Э.А. Орлина разработала оригинальную методику РИФ-абс со свежей капиллярной кровью, взятой из пальца, что можно использовать при обследовании детей и больших групп населения.

Еще в 1961—1965 гг. ряд зарубежных авторов указали на перспективность использования РИФ при ликвородиагностике сифилиса, В нашей стране наиболее глубоко изучила этот вопрос Н.И. Яковлева, показавшая целесообразность реакции с цельным ликвором (РИФ-ц), установившая высокую чувствительность и специфичность данного теста, большую устойчивость флюоресцирующих антител при хранении образцов спинномозговой жидкости, а также возможность использования для реакции антигена из культуральных бледных трепонем.

Niel, Fribourg-Blanc придавали большое диагностическое и прогностическое значение концентрации флюоресцирующих антител в сыворотке крови и ликворе больных сифилисом, в частности, в процессе лечения.

Несмотря на высокую диагностическую ценность, использование РИФ ограничивают длительность, трудность автоматизации теста, значительная стоимость исследований, необходимость высокой квалификации персонала лабораторий. Данная реакция рекомендуется для подтверждения серологического диагноза сифилиса и распознавания биологически ложноположительных результатов, полученных в липоидных тестах.

Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA-enzymelinked immunosorbent assay). В последние годы при многих инфекционных заболеваниях для выявления специфических антител широко изучается новый диагностический тест — ИФА на поверхности твердофазного носителя.

Начало разработки ИФА относится к 1966 г., когда Nakane и соавт. описали обнаружение комплекса антиген — антитело в тканях при мечении антител ферментами. В 1967 г. Catt и соавт. сообщили о прочном соединении антигена и антитела с поверхностью полистироловой посуды, В 1969 г. Avrameas предложил метелку конъюгирования белков и ферментов с помощью глютарового альдегида.

Основные принципы ИФА на поверхности твердофазного носителя разработали Engvall и соавт. и Avrames. По механизму реакции, чувствительности и специфичности ИФА близок к РИФ, но отличается от нее тем, что антиген может быть некорпускулярным, а для метки антивидовой иммунной сыворотки вместо флюорохрома используется фермент, чаще пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза. Антигеном сенсибилизируют пробирки, лунки пластин, шарики либо палочки из полистирола, поливинилхлорида, акрила или других носителей. Исследуемые сыворотки крови сорбируют для удаления неспецифических антител, в первой фазе реакции на антиген наносят исследуемую сыворотку крови, во второй фазе — антивидовой конъюгат, в третьей фазе — субстрат для выявления фермента.

Образование комплексов антиген — антитело на поверхности твердофазного носителя и обнаружение химическим путем фермента позволяет оценивать результаты ИФА визуально по степени изменения окраски субстрата под действием фермента, входящего в состав конъюгата.

Впервые для выявления сифилитических антител ИФА на твердофазном носителе применили Veldkamp, Visser, высоко оценив его чувствительность, Morrison-Pluminer и соавт. установили наиболее высокую чувствительность теста при использовании в качестве антигена протеина наружной оболочки бледных трепонем. Хорошие результаты, по данным MarschaIko и соавт., Сох и соавт., обеспечивал и антиген из культуральных бледных трепонем.

Stevens, Schmitt (1985) при параллельном исследовании в ИФА и РИФ-абс 218 сывороток крови больных различными формами сифилиса установили близкую чувствительность этих тестов (99,5% и 100 % соответственно) как при ранних, так и поздних формах заболевания. Авторы отметили также высокую специфичность теста, легкость его выполнения и учета результатов, приравняв его диагностическую ценность к РИФ-абс.

В России методика ИФА для серо- и ликвородиагностики сифилиса с отечественными ингредиентами и материалами разработана нами совместно с А.В. Котровским. Ее особенностью является использование антигена из ультраозвученных культурных бледных трепонем и сорбента для исследуемых сывороток крови в виде бессолевого мясо-пептонного бульона с 3 % содержанием пептона.

Исследование А.В. Котровским образцов сыворотки крови и спинномозговой жидкости больных сифилисом и свободных от этой инфекции лиц показало высокую чувствительность (98,9%) и специфичность (99,1%) реакции. Установлена аналогичная чувствительность ИФА с антигенами из патогенных и культуральных бледных трепонем и участие в ИФА и РИФ одних и тех же антител.

В России организован производственный выпуск диагностической тест-системы ИФА для серо- и ликвородиагностики сифилиса, Наборы содержат все необходимые для реакции ингредиенты, в инструкции изложена ее методика.

Недостоверные результаты ИФА могут быть получены при неточном разведении ингредиентов, нарушении температурного и временного режимов, несоответствии pH растворов требуемым, а также при загрязнении лабораторной посуды и неправильной технике промывки носителя.

Данные отечественных и зарубежных авторов указывают на возможность использования ИФА для специфической, серо- и ликвородиагностики сифилиса, а при автоматизации теста — для обследования на сифилис больших групп людей.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА; TPHA — Treponema pallidum Hacmagglutination test). Для диагностики ряда инфекционных заболеваний широко применяют РПГА, позволяющую в различных биологических жидкостях определять как антигены, так и антитела. Внедрение в практику данного теста обусловлено его высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью, а также экономичностью и возможностью автоматизации.

Первое сообщение о применении РПГА для выявления сифилитических антител было сделано в 1932 г. Blumental, Bachman. Более детально этот тест изучили и предложили в качестве диагностического Rathlev, Tomizawa и соавт. Японские исследователи разработали тест-систему РПГА при сифилисе, которая стала коммерческой и большинство авторов за рубежом с успехом ее использовали.

Разработаны автоматизированный вариант теста AMHA—ТР, микромодификация MHA—TP. В 1983 г. Kobayoeshi и соавт. предложили использовать для сенсибилизации трепонемным антигеном окрашенные стабильные микрокапсулы из полимочевины вместо эритроцитов (MCA—TP).

Многие авторы чувствительность и специфичность РИГА считает аналогичными таковым РИТ и РИФ, другие отмечают ее меньшую чувствительность по сравнению с РИФ-абс при ранних формах сифилиса, но большую диагностическую ценность в поздние стадии заболевания и при врожденном сифилисе.

Значительный интерес с экономической точки, зрения представляют данные ряда авторов, показавших возможность использования в качестве антигена для РGГА культуральных бледных трепонем, что ставит РИГА в ряд скрининг-тестов.

Diggory полагает, что для массового обследования населения на сифилис лучше всего применять два теста — VDRL и TPHA, так как VDRL более чувствительна при первичном сифилисе, a TPHA — а поздние стадии заболевания, когда VDRL в 30 % случаев бывает отрицательной.

В России Г.Ф. Тимченко, Н.Н. Басова, В.Н. Беднова разработали методику получения стандартного диагностикума для РПГА из патогенных бледных трепонем. Сравнительное изучение в ЦКВИ Минздрава России РПГА с отечественными ингридиентами. РИТ, РИФ-абс, KCP и MP показало высокую чувствительность и специфичность РПГА при сифилисе, совпадающую с РИФ-абс. Установлена также возможность приготовления диагностикума из культуральных бледных трепонем без снижения диагностической ценности реакции. РПГА ставят в качественном и количественном вариантах, существуют макро- и микромодификации.

Методика качественной РПГА. Макромодификация. В 3 лунки полистироловой пластины наливают по 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую и третью лунки добавляют по 0.4 мл исследуемой сыворотки крови в исходном разведении (1:125). Содержимое лунок перемешивают, из первой лунки 0,4 мл переносят во вторую, перемешивают и по 0,4 мл удаляют из третьей и второй лунок. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,05 мл (по одной капле) трепонемного эритроцитарного диагностикума, в третью лунку — 0,05 мл несенсибилизированных эритроцитов. Осторожным покачиванием пластины доводят смесь в каждой лунке до гомогенного состояния и оставляют пластину на неподвижной поверхности на белой бумаге, чтобы читать результат, не двигая пластину.

Микромодификация. При РПГА в микромодификации используют микротитраторы типа Такачи. Реакция отличается объемными соотношениями и концентрацией эритроцитов. Объем Разведенной сыворотки крови равен объему добавляемого диагностикума — 0,025 мл, Прокаленными и остуженными термостойкими петлями для титрования вносят в первую и третью лунки исследуемую сыворотку крови, добавляя ее к 0,025 мл изотонического раствора хлорида натрия, внесенного в 3 лунки. Термостойкой петлей перемешивают жидкость и захватывают из лунки 0,025 мл смеси, которую переносят из первой во вторую лунку, а затем из второй и в третью. Доведенный до рабочего разведения трепонемный антигенный диагностикум капельницей с мерной насадкой вносят в первую и вторую лунки, а в третью лунку добавляют контрольные эритроциты.

При получении положительного результата в первых двух лунках исследуемая сыворотка крови должна быть изучена количественным методом макро- или микромодификации РПГА с целью определения титра специфических антител.

Методика количественной РПГА, Mакромодификация. В лунки полистироловой пластины наливают по 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую и последнюю лунки одного ряда добавляют по 0,4 мл исследуемой сыворотки крови в исходном разведении (1:125). Содержимое первой лунки перемешивают пипеткой или шприцем-дозатором и переносят по 0,4 мл из каждой предыдущей лунки в последующую, 0,4 мл из предпоследней лунки вылинают. Затем во все лунки, кроме последней, добавляют по 0,05 мл (по 1 капле) диагностикума, в последнюю лунку — 0,05 мл контрольных эритроцитов.

Mикромодификация. Прокаленными и остуженными петлями для титрования исследуемую сыворотку крови вносят в изотонический раствор хлорида натрия первой лунки. Петлей перемешивают жидкость и захватывают из лунки 0,025 мл смеси, которую переносят в следующую лунку. Таким, образом, производят титрование с двукратным интервалом и получают ряд разведений исследуемой сыворотки крови от 1:250 до 1:8000—1:16 000. В последнюю лунку капельницей вносят 0,025 мл исходного разведения сыворотки крови для контроля. Доведенный до рабочего разведения диагностикум вносят по 0,025 мл в каждую лунку, кроме последней, куда добавляют контрольные эритроциты (0,025 мл).

Обязательные контрол и РПГА. 1. Отсутствие спонтанной агглютинации, В две лунки вносят по 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия (по 0,025 мл для микрометода), затем в одну лунку — диагностикум, а в другую — контрольные эритроциты по 0,05 мл (0,025 мл для микрометода).

2. Определение активности диагностикума. Используют заведомо позитивную сыворотку крови (4+, 3+) в разведении не менее 1:500 для макрометода и 1:200 для микрометода. Воспроизводимость установленного титра указывает на активность диагностикума.

Учет результатов. Результаты РПГА учитывают через 1,5—2 ч для микромодификации и через 2—4 или на следующий день для макромодификации. Неподвижно стоящие пластины даже при высыхании их содержимого сохраняют картину результата.

Оценка результатов реакции:

4+ — положительная РПГА. Эритроциты равномерно устилают всю поверхность лунки (в виде зонтика).

3+ — положительная РПГА. Эритроциты устилают всю поверхность лунки, часть их соскальзывает к центру.

2+ — слабоположительная РПГА, Эритроциты образуют пленку на небольшом участке.

1+ — отрицательная РПГА. Эритроциты ровным «колечком» или «пуговкой» лежат на самом дне лунки (без окружающего зернистого осаждения).

Антителообразование при сифилисе. Динамика образования антител в организме больных сифилисом наиболее полно изучена за последние годы. Установлено, что уже на 2-й неделе после заражения бледной трепонемой вырабатываются трепонемоспецифические IgM, наибольшее количество которых приходится на 6—9-ю неделю заболевания, а затем снижается и в течение многих лет может оставаться на низком уровне.

Трепонемоспецифические IgG продуцируются позже. Появляясь в конце 4-й недели после заражения, они наблюдаются по мере развития заболевания все в большей концентрации, на 6-й неделе начинают преобладать над IgM и достигают максимума через 1—2 года после заражения.

Для сифилидологов представляет особенный интерес динамика этих антител после лечения. Если специфические IgM в процессе терапии и после ее окончания вырабатываются все меньше и в течение 2 лет перестают определяться, то IgG держатся на довольно высоком уровне многие годы. Ряд авторов связывают это с деятельностью «клеток памяти». Поскольку иммобилизины, флюоресцирующие антитела и гемагглютинины связаны с IgG, они определяются длительное время после лечения. Однако флюоресцирующие антитела могут относиться и к IgM, что объясняет положительные результаты РИФ при сифилисе первичном серонегативном и даже в инкубационном периоде заболевания. Реагины, по данным Kiraly и соавт., обнаруживаются как в IgM, так и в IgG, причем в начале заболевания в IgM, затем — в IgG, а при поздних формах заболевании — вновь в IgM, При леченом раннем сифилисе они исчезают прежде всего из IgM, а затем из IgG.

Для суждения об эффективности лечения предложено несколько тестов, направленных на определение специфических IgM.

С 1966 г. изучается методика РИФ с моноспецифическим конъюгатом против TgM—IgM—FTA—ABS. С помощью данного теста стало возможным выявлять трепонемоспецифические IgM-антитела, но уменьшение их количества после лечения приводило к все большему преобладанию в крови IgG-антител, которые становились конкурирующими и обусловливали ложноотрицательные результаты теста IgM—FTA—ABS. В 1977 г. была предложена реакция 19S—IgM—FTA—ABS, на которую возлагали большие надежды как на критерий излеченности сифилиса. Однако трудоемкость теста, необходимость дорогостоящего оборудования для разделения Ig испытуемой сыворотки крови, а также потребность в высококвалифицированном персонале ограничили ее применение.

В последние годы изучается реакция гемабсорбции на твердофазном носителе (IgM—SPHA.), описанная Schmidt в 1980 г. Этот простой в выполнении тест объединяет элементы РПГА и ИФА и позволяет определять изолированно специфические IgM-антитела. Merlin и соавт. считают аналогичной чувствительность IgM—SPHA и IgM—FTA — ABS, но отмечают более высокую специфичность первого теста (97,4 и 89,6 % соответственно), Подобная закономерность установлена и Gibowski и соавт..

Особую ценность IgM—SPHA представляет для определения активности процесса, выявления рецидива заболевания и реинфекции на фоне положительных серологических реакций после лечения, диагностики раннего врожденного сифилиса, а также для суждения об излеченности заболевания и распознавания ложноположительных результатов других серологических реакций. Однако недостаточная чувствительность IgM—SPHA указывает на необходимость совершенствования этого теста.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также