Высокая генотоксическая устойчивость сетчатки глаза

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

Полученные нами результаты по облучению и действию MHM подтверждают тезис о высокой генотоксической устойчивости зрелой сетчатки мышей. Одна из предпосылок к этому — активная репарация ДНК после действия у- и протонного излучений в дозе 14 Гр. Репарация сочетается с увеличенной экспрессией Р53 и ATM, которая нормализуется спустя 12 ч после облучения, времени завершения репарации индуцированных излучениями разрывов в ДНК.

Заметные морфологические изменения в фоторецепторном слое сетчатки глаза отмечаются после облучения в дозе 25 Гр. Эти изменения выражаются в деградации наружных сегментов фоторецепторов сетчатки, а также в снижении плотности и толщины ядерного слоя фоторецепторов. Деградация нарастает во времени и связана с гибелью фоторецепторов, протекающей по механизму апоптоза. На апоптоз указывает возросшая экспрессия проапоптотических белков Р53, FasR и активной каспазы 3. Все это в совокупности наблюдается и при действии MHM на сетчатку глаза. Высокая устойчивость сетчатки и активный механизм репарации ДНК указывают на существование генотоксического порога, который обуславливает нелинейный характер зависимости эффекта от дозы агентов. На пролиферирующих клетках генотоксический порог наблюдался при действии алкилирующих агентов. Он выражался в нелинейной зависимости эффекта от дозы и прямо связан с активной системой репарации ДНК.

Исследование генотоксического действия MHM обнаружило две ранее не описанные особенности сетчатки глаза. Во-первых, высокую спонтанную поврежденность ДНК в сетчатке глаза мышей. По этому показателю органы мыши располагаются в порядке возрастания поврежденности ДНК в клетках — лимфоциты < клетки печени < клетки мозга < клетки сетчатки, который совпадает со степенью оксигенации тканей. Средний момент хвоста ssДНК-комет интактной сетчатки, mt=32±2, соответствует дозе облучения протонами 15-20 Гр. Такая доза облучения неизбежно индуцирует заметное повреждение и dsДHK в сетчатке. Однако интактная сетчатка в нейтральных условиях, dsДНК, не обнаруживает разрывов, хотя форма комет, напоминающая одуванчики, указывает на декомпактизацию хроматина в клетке и на ослабление его связи с ядерным матриксом. Все это говорит о том, что спонтанные повреждения ДНК в сетчатке не являются разрывами, но трансформируются в таковые в щелочных условиях (рН≥13), то есть являются ок-си-модифицированными основаниями ДНК.

Вторая обнаруженная нами особенность сетчатки — активная репарация, удаляющая большую часть повреждений ДНК, индуцированных облучением и МНМ, но не затрагивающая пред существующие спонтанные повреждения ДНК (см. рис. 14). Спонтанные повреждения в виде однонитевых разрывов ДНК в различных органах мышей отмечались в работах. Степень поврежденности ДНК нарастала в клетках в том же порядке, что и у нас: лейкоциты < клетки печени < клетки мозга. Таким образом, наличие таких нерепарируемых дефектов в ДНК интактной сетчатки глаза и снижение ее функций и жизнеспособности тоже говорит о высокой генотоксической устойчивости.

Апоптоз в ответ на повреждение ДНК в пролиферирующих клетках признается радикальным способом предотвратить формирование генетически нестабильного потомства клеток. В случае дифференцированных клеток не ясно, способны ли они подвергаться апоптозу в ответ на генотоксический стресс. Известно, что в постмитотических клетках подавлены отдельные механизмы репарации. Так, терминально дифференцированные клетки не способны осуществлять репарацию по механизму гомологичной рекомбинации, ассоциированному с репликацией. Кроме того, в этих клетках регуляторно подавлена глобальная репарация генома, одна из разновидностей механизма NER. Вместе с тем, терминально дифференцированные клетки транскрипционно активны и нуждаются в поддержании целостности транскрибируемой части генома на протяжение жизни клетки. Эту функцию выполняет механизм репарации, ассоциированный с транскрипцией. Принимая во внимание эти факты, можно считать большую часть глобального генома терминально дифференцированных клеток (в т.ч. и клеток сетчатки) некритичной для выполнения их специфических функций. Поэтому репарацией ДНК в этой части генома клетка может до какой-то степени пренебречь. В результате в ней могут накапливаться спонтанные повреждения без очевидных цитотоксических последствий. Спонтанная поврежденность ядерной ДНК в сетчатке отражает толерантность клеток к генотоксическому стрессу.

Таким образом, наши результаты показывают, что, так же как для делящихся клеток, одной из причин толерантности постмитотических клеток сетчатки к повреждениям ДНК является репарация. Вторая причина их толерантности — уменьшение физического размера радиочувствительной мишени до размеров транскрибируемого локуса генома. Мы предполагаем, что решающая роль в трансформации изначально пермиссивных повреждений ДНК (разрывов после облучения и модифицированных оснований и АП-сайтов после действия МНМ) в цитотоксическое принадлежит локализованным в транскрибируемых сайтах молекулам топоизомеразы 2 (topo 2).

Известно, что регуляция генной экспрессии осуществляется путем структурной перестройки (remodeling) хроматина и формированием петель. Важная роль в этом принадлежит топоизомеразе topo 2, входящей в состав комплекса, осуществляющего модификацию. Topo 2 локализована в транскрибируемой области, где изменяет топологию ДНК, делая в ДНК временный двойной разрыв и лигируя его в последующем, благодаря своим эндонуклеазной и лигазной функциям. Активацию эндонуклеазной активности topo 2 могут осуществлять как индуцированные внешним воздействием, так и спонтанно возникающие повреждения ДНК. В результате в транскрибируемых локусах формируются нерепарируемые двунитевые разрывы, приводящие к образованию высокомолекулярных (300-0,5 Mb) фрагментов dsДHK, являющихся ранним маркером апоптотической деградации генома. В работе показано, что для инициации этих процессов необходимо попадание повреждения в область, перекрываемую эндонуклеазной активностью topo 2. В противном случае повреждение может быть репарировано, не вызвав цитотоксического эффекта. Этот механизм объясняет как наличие генотоксического порога и вклад репарации в его формирование, так и, в конечном счете, процесс трансформации повреждения ДНК в цитотоксический эффект в постмитотических клетках сетчатки.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также