Влияние субхронического системного введения пептида TGeNHR-NH2 на характеристики рецепторного связывания на мембранах мозга мышей линий C57BI/6 и Balb/c методом ex vivo анализа

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

Выбор лиганда для радиорецепторных исследований ex vivo осуществляли в соответствии с рекомендациями IUPHAR. При радиолигандном анализе NMDA-рецепторов использовали [3H-G](+)MK-801, синтезированный реакцией ВТКИО с молярной радиоактивностью 210 Ки/ммоль. Молярная радиоактивность этого препарата на порядок выше, чем у коммерчески доступного селективно меченного тритием препарата фирмы NEN. Для анализа серотонино-вых 5-НТ1а и никотиновых н-АХ-рецепторов использовали [С-3Н]кетансерин и (-)[G-3Н]никотин с молярной радиоактивностью 114 и 140 Ки/ммоль, соответственно.

Рецепторный компонент механизма действия пептида был проведен сравнительным анализом изменения плотности NMDA-глутаматных, 5-НТ2а-серотоминовых и н-АХ-никотиновых рецепторов на мембранах префронтальной коры и гиппокампа мозга мышей инбредных линий С57В1/6 и Balb/c. Мыши линии Balb/c с исходным когнитивным дефицитом характеризуются меньшей плотностью исследуемых рецепторов.

Плотность мест связывания [G-3H]MK-801 с NMDA-рецепторами в гиппокампе мышей линии Balb/c меньше на 23%, чем у мышей линии С57В1/6. Плотность мест связывания 5-НТ2а-серотониновых и н-АХ-никотиновых рецепторов на мембранах префронтальной коры мозга также оказалась на 30-35% меньшей у мышей линий Balb/c, чем у мышей линии С57В1/6.

Ткань гиппокампа гомогенизировали в гомогенизаторе Potter S («тефлон-стекло») в 10 объемах 5 мМ HEPES и 4,5 мМ Tris-base (рН=7,6), содержащего 0,32 M сахарозу (буфер №1). Гомогенат разбавляли до 50 объемов буфера для исследования 2 (5 мМ HEPES и 4,5 мМ Tris-base) (рН=7,6) и центрифугировали 10 мин при 1000 g. Супернатант отбирали и вновь центрифугировали 20 мин при 25 000 g. Осадок гомогенизировали в 50 объемах буфера 2 и центрифугировали 20 мин при 8 000 g. Супернатант и его мягкий, зыбкий надслой отбирали и центрифугировали 20 мин при 25 000 g. Полученный осадок суспендировали в буфере 3 (5 мМ HEPES и 4,5 мМ Tris-base, содержащем 1 мМ Na4EDTA, рН=7,6 и суспензию вновь центрифугировали. Такую процедуру отмывки проводили четырежды, причем при последней отмывке EDTA был исключен из состава. Конечный осадок ресуспендировали в 5 объемах буфера 2 и сохраняли в жидком азоте.

Реакционная смесь содержала 200 мкл буфера 2,50 мкл меченого лиганда (50 нМ) и 250 мкл белковой суспензии. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл немеченого лиганда. Инкубационная смесь содержала 200 мкл буфера 2, 50 мкл меченого лиганда (50 нМ) и 250 мкл суспензии белка. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл немеченого (+)МК-801. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Измерение радиоактивности осуществляли жидкостно-сцинтилляционным методом на счетчике TriCarb TR290. Эффективность счета составляла 42-47%. Показатели количества мест связывания лиганда (В фмоль/мг белка) и константу диссоциации лиганд-рецепторных комплексов (Kd, нМ) рассчитывали с помощью программы GraphPadPrizm 4 Demo, статистическую обработку проводили по программе Statsoft 6,0. Концентрацию белка определяли стандартным методом Лоури.

Результаты радиорецепторного анализа связывания лиганда [3H-G](+)MK801c NMDA-рецепторами, участвующими в регуляции когнитивных форм поведения, были представлены после обработки по Скетчарду (рис. 9).

р9

Анализ влияния на NMDA-рецепторы гиппокампа мышей линии Balb/c показывает, что субхроническое введение пептида приводит к возрастанию величины Bmax, отражающей плотность соответствующих рецепторов, с 2115±36 фмоль/мг белка в контрольной группе до 2527±43 фмоль/мг белка после субхронического введения препарата. В то же время, в мозге мышей С57В1/6 изменения в рецепторных характеристиках не отмечаются: плотность мест связывания лиганда в контрольной группе — 2734±44 фмоль/мг, а после субхронического введения препарата эта величина составила 2625±55 фмоль/мг белка.

После 5-кратного системного введения амидной формы пептида TGENHR-NH, в ежедневной дозе 100 мкг/кг величина плотности мест связывания [G-3H]MK-801 с NMDA-рецепторами в гиппокампе мышей Balb/c увеличилась на 21% относительно интактного контроля. При этом величина плотности NMDA-рецепторов в гиппокампе мышей Balb/c приблизилась к соответствующему значению для группы сравнения, представленной мышами линии С57В1/6, относительно которой препарат был неэффективен. Субхроническое введение пептида в равной степени уменьшало плотность 5-НТ2a-серотониновых рецепторов у обеих линий и не оказывало влияния на никотиновые н-АХ-рецепторы (табл. 1). Результаты, полученные при исследовании влияния амидной формы пептида HLDF-6 на нейрохимические процессы с помощью радиолигандного анализа, показывают, что в механизм этих фармакологических эффектов с высокой степенью вероятности вовлечена глутаматергическая система гиппокампа, в частности NMDA-тип рецепторов. NMDA-рецепторы являются одной из важнейших мишеней для воздействия ноотропных и нейропротекторных лекарственных препаратов, так как они принимают определяющее участие в регуляции уровня выживаемости и гибели.

т1

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также