Влияние нейролипинов на нейрональный апоптоз

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

Модель калиевой депривации является одним из распространенных способов изучения нейронального апоптоза. Нейроны мозжечка крысы сохраняют жизнеспособность при культивировании в среде с повышенным содержанием ионов калия (25 мМ). При понижении концентрации калия до 5-10 мМ в течение 18-24 часов наблюдается массовая гибель нейронов по пути апоптоза. В данной модели были протестированы аналоги анандамида, 2АГ, ACT и АДА. В исходной постановке опыта все вещества исследовали в трех концентрациях: 0.1, 1,10 мкМ. Анандамид, 2АГ и ACT, а также их аналоги в данном тесте оказались неактивны. Среди N-ацилдофаминов нейрозащитное действие проявили АДА и N-докозагексаеноилдофамин (ДДА, 1а-5e). Максимальный эффект наблюдали при концентрации 10 мкМ: 59% и 39% выживших клеток для АДА и ДДА, соответственно. Для этих соединений было проведено исследование зависимости защитного эффекта от концентрации (рис. 4).

р4

АДА увеличивал выживаемость нейронов в диапазоне концентраций 1-15 мкМ (30-65% выживших клеток), тогда как ДДА был активен в интервале 5-30 мкМ (10-85% выживших клеток). Применение антагонистов каннабиноидных, ванилоидных и дофаминовых рецепторов показало, что эффекты N-ацилдофаминов реализуются преимущественно за счет КР2 и BP1 (рис. 5). Аналоги АДА с модификациями в дофаминовой части не оказывали достоверного защитного действия.

С учетом биохимических характеристик нейролипинов, описанных выше, нами была применена комбинация соединений, состоящая из нейролипина и ингибитора его гидролиза. Были использованы АДА и ДДА в комбинации с наиболее активным ингибитором ГАЖК N-эйкозапентаеноилсеротонином (ЭСТ, 1с-4b).

р5

Было установлено, что ЭСТ снижает эффективную концентрацию АДА и ДДА в условиях К+-депривации. В присутствии АДА (5 мкМ) и ДДА (10 мкМ) выживание клеток повышалось на 30-40% по сравнению с контролем. На фоне повышающейся концентрации ЭСТ 1-10 мкМ наблюдали усиление нейропротекторного эффекта АДА и ДДА до 80-90% (рис. 6). Эффект комбинации ДДА+ЭСТ заметно уменьшался в присутствии антагониста КР2, тогда как антагонист KPl на него не влиял.

Характерными признаками развития апоптоза являются активация кальций-зависимых протеаз (каспаз) и фрагментация ядерной ДНК.

р6

Электрофоретический анализ ДНК, выделенной из клеток, показал, что при инкубации с АДА и ДДА количество фрагментов с характерной длиной 180 пар оснований заметно снижается по сравнению с контролем (данные не приведены). Оценку активности каспаз 3 и 9 в культуре нейронов проводили с использованием флуоресцентно меченых субстратов. Было показано, что при К+-депривации увеличивается активность обеих каспаз, что свидетельствует в пользу развития гибели нейронов по пути апоптоза в данной модели. В присутствии АДА и ДДА активность этих ферментов снижена в 4-5 раз (рис. 7), что служит подтверждением антиапоптотического действия этих соединений.

р7

Для выяснения возможных путей внутриклеточной сигнализации, задействованных в защитном эффекте АДА и ДДА, проведен ингибиторный анализ ряда клеточных протеинкиназ. Для этого АДА и ДДА применяли в сочетании с ингибиторами фосфоинозитол-3-киназы (PI3K), протеинкиназы A (PkA), протеинкиназы С (PkC), калций-кальмодулин-зависимой киназы 2-го типа (CaMK-II), киназ, активируемых внеклеточными сигналами (МЕКК, MEK-1,2). В присутствии ингибиторов PI3K, PkC и CaMK-II наблюдали выраженное снижение нейропротекторного действия АДА и ДДА, что может свидетельствовать в пользу участия этих протеинкиназ во внутриклеточных каскадах, приводящих к повышению жизнеспособности нейронов под действием этих нейролипинов (рис. 8).

р8

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также