ВЭЖХ-анализ синтетического А2Е и продуктов его облучения

Как уже отмечалось ранее, начальные пики при хроматографическом анализе хлороформного экстракта из ЛГ могут быть продуктами фотоокисления и фотодеградации А2Е. Для определения природы этих продуктов были изучены продукты фотоокисления и фотодеградации А2Е на модельной системе. Облучение синтетического А2Е полным видимым светом приводит к его фотоокислению и образованию новых продуктов (рис. 6). Спектр поглощения раствора А2Е в ацетонитриле (кривая 1) имеет два характерных максимума в области 330 и 435 нм. После облучения раствора А2Е видимым светом в течение 2 часов оба максимума в области 330 и 435 нм значительно уменьшаются, и в то же время появляется более коротковолновый максимум в районе 280 нм (кривая 2). Можно предположить, что происходит образование новых фотоокисленных продуктов А2Е.

Для выяснения природы продуктов фотоокисления А2Е был проведен масс-спектрометрический анализ растворов синтетического А2Е в ацетонитриле до и после облучения (рис. 7). Показано, что после облучения помимо основного пика с отношением M/Z 592 (М+), соответствующего неокисленной форме молекулярного иона А2Е, появляются новые пики с M/Z 608, 624, 640 и 656, каждый из которых отличается от предыдущего по массе на 16 и соответствует окисленным формам А2Е. По мере увеличения времени облучения количество окисленных форм А2Е растет по отношению к исходной неокисленой форме, о чем свидетельствует относительное увеличение интенсивности пиков с M/Z 608, 624, 640 и 656 по отношению к пику с M/Z 592. Образование нескольких новых окисленных форм А2Е хорошо согласуется с данными, полученными методом ВЭЖХ-анализа. Также была проведена идентификация отдельных пиков в масс-спектре с помощью индуцированной столкновениями диссоциации (CID). Основываясь на результатах этих данных, можно утверждать, что в растворе облученного А2Е присутствуют как эпокси, так и фураноидные продукты окисления А2Е.

Мы провели сравнительный ВЭЖХ-анализ синтетического А2Е и продуктов его облучения (рис. 8). Исследование раствора А2Е до и после облучения показало, что при фотоокислении А2Е образуются, по крайней мере, два основных новых продукта (см. рис. 8Б, пики оху-А2Е). He исключено также, что каждый из них может представлять собой смесь изомеров, или очень близких по своим свойствам веществ. На фоне образования этих новых продуктов наблюдается снижение количества А2Е, что является еще одним доводом, подтверждающим образование этих новых продуктов в результате химических реакций А2Е. На рис. 8 (А и Б — 1) представлены хроматограммы с детектированием по поглощению на длине волны 430 нм. На рис. 8 (А — 1) представлены данные ВЭЖХ-анализа синтетического А2Е. Относительное содержание А2Е и его изоформ в исследуемом образце составляет около 87% (табл. 2). После облучения этого образца белым светом в течение 2 часов на хроматограмме (рис. 8, Б — 1) появляются новые пики (оху-А2Е), соответствующие окисленным формам А2Е, идентифицированным в работе, а также других продуктов фотоокисления и фотодеградации А2Е, детектируемых на более коротких временах удерживания. Как видно из табл. 2, относительное содержание А2Е и его изоформ уменьшается до 10%.

На хроматограммах с детектированием по поглощению можно условно выделить три группы детектируемых веществ в хлороформном экстракте (см. рис. 8 А и Б — 1). Первая группа — это вещества (A2Eox,deg), которые детектируются на самых ранних временах, включая продукты оху-А2Е. Мы предполагаем, что эти вещества могут быть продуктами фотоокисления и фотодеградации А2Е и ПТР-димера. Из этой группы мы идентифицировали продукты, обозначенные на рис. 8 (А и Б — 1) как оху-А2Е. Согласно масс-спектрометрическому анализу, эти продукты представляют собой эпокси и фураноидные продукты окисления А2Е, образованные при взаимодействии бисретиноида с одним или двумя атомами кислорода. Вещества второй группы — это А2Е и iso-A2E. В состав третьей группы (А2Е ) могут входить бисретиноиды, такие как ПТР-димер, ПТР-димер-Е, A2-DHP-E, A2-GPE.

Результаты ВЭЖХ-анализа при возбуждении флуоресценции на длине волны 430 нм и детектировании эмиссии при 500 и 600 нм представлены на рис. 8 (А и Б — 2 и 3, соответственно). Следует отметить, что интенсивность флуоресценции необлученного А2Е по сравнению с его поглощением существенно меньше. Интересно отметить, что iso-A2E практически не проявляет флуоресцентных свойств. На хроматограммах с флуоресцентным анализом продуктов облучения А2Е также детектируется появление новых пиков (см. рис. 8Б — 2 и 3).