Современные представления о роли убиквитин-протеасомной системы в патогенезе болезни Паркинсона

Декабрь 4, 2015 / Комментарии 0

Убиквитин-протеасомная система осуществляет чрезвычайно важную функцию, которую еще недавно недооценивали, — постоянную деградацию большинства клеточных белков. Протеасома — (от англ. protease — протеиназа и лат. soma — тело) — белковый комплекс, содержащийся в цитоплазме и ядре эукариотических клеток, 26S-протеасома образуется в результате связывания 2 регуляторных 198-частиц с 208-протеасомой. Большинство белков направляются в 268-протеасому после прикрепления к ним полиубиквитиновой цепочки, фермент убиквитин-лигаза контролирует специфичность процесса деградации белков. За открытие «каскадного» механизма расщепления белков в протеасоме трем исследователям (A. Hershko, F. Ciechanover, I. Rose) в 2004 г. присуждена Нобелевская премия по химии. Протеасомная система осуществляет деградацию большинства внутриклеточных белков, включая ключевые регуляторные белки (циклины, фосфатазы, киназы, факторы транскрипции и трансляции и др.), и вовлечена в регуляцию клеточного цикла, транскрипции и трансляции, передачи сигналов, образования синапсов, синаптической пластичности, реакции клеток на различные стрессовые воздействия и множества других жизненно важных процессов.

Снижение функции убиквитин-протеасомной системы — ключевой механизм болезни Паркинсона

В последние годы обращается внимание на неправильную укладку белков как на наиболее серьезную угрозу для функционитрования и выживания клеток и основную причину развития нейродегенеративных заболеваний. Протеасомная система препятствует неправильной укладке белков, обеспечивая сохранение здоровой популяции клеток за счет деградации аномальных белков в цитоплазме, ядре и эндоплазматической сети.

Ослабление работы протеасомной системы, ответственной за своевременную деградацию большинства белков (в первую очередь, мутантных, поврежденных и состарившихся), приводит к нарушению укладки белков и накоплению в нейронах токсичных олигомеров белка α-синуклеина. Связанная с этим механизмом дегенерация клеток в различных структурах мозга, в том числе ДА-ергических нейронов черной субстанции и их аксонов в стриатуме, играет существенную роль при старении и в патогенезе спорадической и наследственной форм БП.

Основные принципы моделирования стадий болезни Паркинсона на основе дисфункции протеасом нигростриатной системы

Одна из причин «неизлечимости» БП — поздняя постановка диагноза — через 10-30 лет от начала болезни, когда погибают более половины ДА-ергических нейронов черной субстанции и их аксонов в стриатуме и проявляются моторные симптомы. Важнейшей задачей является разработка адекватных моделей БП у животных, особенно моделей доклинической стадии, которые направлены на вмешательство в ключевые механизмы патогенеза, воспроизводят стадии нейродегенеративного процесса и позволяют ускорить поиск ранних симптомов БП и выяснение компенсаторных и нейропротективных механизмов, необходимых для обоснования стратегии превентивной терапии.

В настоящее время широко известны модели БП у животных с применением нейротоксинов (6-гидроксидофамина, ротенона, параквата, манеба). К сожалению, в большинстве моделей воспроизводятся симптомы «неизличимой» клинической стадии БП с глубокой деградацией нигростриатной системы. Адекватные модели доклинической стадии паркинсонизма созданы на мышах линии C57BL/6 на основе пролонгированного действия специфического токсина ДА-ергических нейронов МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина). Детально изучены характеристики компенсаторных процессов, указывающие на активацию резервов нейропластичности нигростриатной ДА-ергической системы, разработаны методы диагностики доклинической стадии на основе химической провокации моторных симптомов, получен ряд других важных фактов. Разработка моделей доклинической стадии БП на основе дисфункции протеасомной системы не проводилась. В ряде работ изучались лишь показатели модели моторной, или клинической стадии, не поддающейся излечению. В обзоре, специально посвященном описанию моделей БП у животных, модели на основе угнетения протеасомной активности вообще не представлены.

При создании моделей паркинсонизма у крыс Вистар на основе дисфункции протеасом нами использован специфический ингибитор ферментативной активности протеасом лактацистин. Лактацистин синтезируется почвенными микроорганизмами (Streptomyces lactacystinaeus и другими) и рассматривается как природный нейротоксин; предполагается, что в течение многих лет он может поступать с пищей и водой и накапливаться в организме человека. При сопоставлении различных методических схем определены оптимальные дозы и временные режимы применения ингибитора. Микроинъекции лактацистина и контрольного раствора выполнялись билатерально в компактную часть черной субстанции через заранее имплантированные проводящие канюли.

Разработке режима пролонгирования мы уделили особое внимание: оно достигалось за счет а) повторного двустороннего введения лактацистина в черную субстанцию в дозе 0,4 мкг (в модели доклинической стадии) и в дозе 4 мкг (в модели клинической стадии) с интервалом 7 суток и путем продления его действия после второго введения до 14 суток (до 21—28 дней от первой микроинъекции нейротоксина). Это в некоторой мере приближает животную модель к длительным срокам развития болезни у человека, уменьшает острые проявления токсических эффектов нейротоксина и дает возможность судить о динамике процесса нейродегенерации, состоянии компенсаторных и нейропротективных резервов и возможности их активации как мишеней для поиска лекарственных средств, способных предотвратить или остановить развитие нейродегенерации.

Выбор черной субстанции в качестве основной мишени при создании модели паркинсонизма имеет несколько веских причин. Во-первых, нигростриатная ДА-ергическая система, включающая нейроны черной субстанциии, их терминали в стриатуме, является ключевым звеном центральной регуляции моторного поведения и его нарушений при БП. Дегенерация ДА-ергических нейронов черной субстанции протекает достаточно длительно в течение 3-ей стадии (у человека это может продолжаться многие годы). Моторные симптомы появляются при потере около половины или более нейронов черной субстанции и их терминалей в стриатуме, что дает возможность на такой микромодели точнее идентифицировать стадии до и после появления моторных симптомов. Во-вторых, черная субстанция отличается от других структур мозга высокой уязвимостью нейронов при старении и действии нейротоксинов, что обусловлено исходно низкой активностью в ней ферментов протеасом. В-третьих, подобное отличие черной субстанции от других структур мозга подтверждено при изучении секционного материала, полученного post mortem у пациентов с БП. Установлено более выраженное снижение в черной субстанции основных ферментов протеасом (в среднем на 50%), α-субъединиц протеасом, ответственных за их сборку и функционирование (на 40%), и экспрессии протеасомных активаторов РА700 и РА28 (в среднем на 33%). Важно, что значительное уменьшение химотрипсин- и трипсиноподобной активностей протеасом отмечено в черной субстанции у пациентов с БП по сравнению с черной субстанцией лиц соответствующего возраста из контрольной группы. В то же время, отсутствие дефицита протеасомной активности или даже ее увеличение были зафиксированы в других отделах головного мозга.

Таким образом, в основу создания наших моделей БП у крыс положен путь специфического пролонгированного ослабления функции протеасом, ведущий к нарушению укладки белка α-синуклеина и дегенерации ДА-ергических нейронов черной субстанции, наиболее уязвимых к этим процессам, характеризующим старение и БП у человека.

Экспериментальное моделирование стадий болезни Паркинсона у крыс на основе пролонгированной дисфункции протеасом нигростриатной системы

При умеренном снижении протеасомной активности на модели доклинической стадии БП у крыс не обнаружено каких либо изменений в уровне двигательной, исследовательской и эмоциональной активности в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт», а также тонких моторных дисфункций, оцениваемых по наиболее чувствительным тестам — «суок», «длина шага» и моторика передних конечностей, рта и языка. При умеренном угнетении функции протеасом отмечаются потеря менее трети ДА-ергических нейронов компактной части черной субстанции и увеличение уровня ключевого фермента синтеза ДА тирозингидроксилазы в этих нейронах на 10%, а также отсутствие изменений в уровне этого фермента в волокнах дорзальной части стриатума. Методом иммуноблоттинга обнаружены сходные изменения уровня тирозингидроксилазы в ткани черной субстанции и стриатума. Наиболее вероятным объяснением повышенного уровня тирозингидроксилазы в черной субстанции может быть активация механизмов мозга, направленных на компенсацию функциональной недостаточности нигростриатной системы. Кроме того, выявлено увеличение средней длительности эпизодов и общего времени парадоксального сна и сохранение нейропротективных резервов нигростриатной системы. Следовательно, на основе пролонгированной дисфункции протеасомной системы разработана модель доклинической стадии БП у крыс, которая не сопровождается дегенерацией большого числа ДА-ергических нейронов компактной части черной субстанции и нарушениями моторного поведения, но приводит к изменениям временных характеристик парадоксального сна как показателя немоторного поведения.

С целью изучения стадийности процесса дегенерации в нигростриатной системе и его последствий разработаны модели клин и ческой стадии БП у крыс Вистар. Показано, что глубокое снижение протеасомной функции, пролонгированное до 21 дня от начала микроинъекций лактацистина, характеризуется: 1) потерей 55-60% ДА-ергических нейронов компактной части черной субстанции и почти 70% их терминалей в стриатуме; 2) появлением первых признаков моторной дисфункции; 3) кратковременным повышением уровня тирозингидроксилазы вследствие уменьшения ее аксонного транспорта. Сравнение данных показывает, что модель умеренного снижения протеасомной функции в ДА-ергической нигростриатной системе воспроизводит признаки доклинической, а модель глубокого снижения — клинической стадии БП. Совокупность этих признаков, включая изменения характеристик сна и уровня шаперона Нsр70, позволяет высказать предположение об ускорении процесса дегенерации ДА-ергических нейронов и крайнем напряжении компенсаторных и нейропротективных механизмов.

Это предположение находит подтверждение при дополнительном пролонгировании протеасомной дисфункции (до 28 дня от начала микроинъекций лактацистина): в течение такого короткого срока потеря ДА-ергических нейронов компактной части черной субстанции увеличивается до 65-70%, их терминалей в стриатуме — до 75%, а повышение уровня тирозингидроксилазы переходит в снижение. Эти трагические изменения, а также более значительное падение уровня шаперона Hsр70, обладающего стресс-защитными свойствами, отражают, очевидно, истощение компенсаторных и нейропротективных резервов нигростриатной ДА-ергической системы и необратимость ее деградации, приближения нейродегенеративного процесса к точке «невозврата».

Создание моделей пролонгированной дисфункции протеасом ДА-ергической системы у крыс, отражающих последовательные этапы развития нейродегенеративного процесса при БП, даст возможность оценивать динамику компенсаторных и нейропротективных резервов, которые могут служить мишенью для поиска лекарственных средств, предотвращающих переход из доклинической в клиническую стадию БП.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также