Разработка пористых матриц-носителей с использованием метода двухфотонной фотополимеризации

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

С начала 1990-х годов было известно, что воздействие на разные материалы ультракоротких лазерных импульсов, в частности фемтосекундных, значительно эффективнее, нежели воздействие лазерных импульсов большей длительности или лазерного излучения в непрерывных режимах. Во-первых, фемтосекундные лазерные импульсы несут много большую пиковую мощность. В обычных световых источниках света напряженность электрического поля световой волны находится в пределах 1 В/см, так что удлинение диполя при таких воздействиях не превышает 10в-16 м, много меньше характерных размеров атомов и молекул (10в-10-10в-8 м).

В то же время, напряженность электрического поля световой волны фемтосекундных лазерных импульсах достигает 10в8 В/см, что вполне достаточно для непосредственного разрыва химических связей. С использованием фемтосекундных импульсов легко могут быть запущены различные нелинейные эффекты, в частности многофотонное поглощение, широко используемое при лазерных технологиях обработки материалов. Многофотонное поглощение реализуется лишь в очень малом 3D-oбъемe в окрестности фокуса. И этот объем не превосходит λ3, где λ — размер длины волны. Тем самым при использовании фемтосекундных лазеров может достигаться при точечной экспозиции высокое 3D-пространственное разрешение. Во-вторых, когда материалы находятся под воздействием фемтосекундных лазерных импульсов, энергия фотонов выделяется много быстрее, нежели электроны могли бы передать ее решетке, или атом-молекулярные колебания могли бы ее передать через эмиссию фононов, так что такое возбуждение оказывается как бы «теплоизолирующим». Это обеспечивает идеальность оптического возбуждения в случае фотохимических или фотофизических реакций, для которых трудно-локализуемые термические эффекты крайне нежелательны. В дополнение к этому, у многих диэлектрических материалов существует окно прозрачности в спектральной красной-ближнеинфракрасной области, которое не перекрывается ни электронным зона-зона-поглощением, ни поглощением атом-молекулярных колебаний. Обычно длина волны фемтосекундных лазеров приходится на это окно прозрачности, например 680-1000 нм для титан-сапфирового лазера. Поэтому излучение фемтосекундного лазера может проникать во внутренние области структур, содержащих материал с определенными областями оптической прозрачности и инициировать различные процессы. Фотополимеризация начинается с поглощения кванта света фотоинициатором (PI), который распадается с образованием 2 радикалов (R•), которые, в свою очередь, разрывают непредельные связи мономера (Mn), обеспечивая постоянное образование радикалов и рост цепи олигомера (RMn).

PI → РI• → R * R * + Mn ->RMn.

Процесс начала полимеризации (сшивки) и последующего роста цепи идентичен как для полимеризации, индуцируемой с помощью традиционных источников света (например УФ-источников и т.д.), так и в случае использования нелинейных эффектов (например 2ФП). Основное отличие этих методов заключается в том, что в первом случае полимеризация инициируется поглощением одного фотона, а во втором — возбуждение происходит при поглощении нескольких фотонов (т.е. при практически одновременном поглощении 2 фотонов, что достигается с использованием ультракоротких лазерных импульсов).

На пространственное разрешение, с которым получаются структуры, оказывает влияние целый ряд факторов, среди которых: размер лазерного пятна, длина волны, мощность лазерного источника, частота и продолжительность лазерного импульса, а также его интенсивность. Если говорить о создании 3-мерных матриц, помимо вышеописанных факторов на линейные размеры структур влияет скорость и погрешность перемещения образца.

Эффект многофотонного поглощения применяется в различных областях технологии, в том числе для создания 3-мерной оптической памяти, изомеризации фотохромных материалов, проведения кавитационных процессов, создания оптических волноводов и т.д. Однако наибольшее распространение этот эффект получил в связи с разработкой метода 2-фотонной полимеризации (2ФП). Оказалось, что с использованием этого метода можно получать структуры с пространственным разрешением порядка 100 нм. При этом для создания таких структур могут применяться композиции, которые подвергаются полимеризации при освещении обычным УФ-светом, хотя механизм возбуждения молекул в обычной полимеризации и 2ФП разный. Такой подход позволяет получать скаффолды, избегая термических воздействий на полимерный материал и без использования легколетучих органических растворителей. Метод 2ФП дает возможность получать объекты с высоким пространственным разрешением, эффективно управлять пористостью получаемых структур, что делает этот метод одним из наиболее перспективных подходов к решению проблемы формирования полимерных матриксов заданной формы для нужд регенеративной медицины.

Возможности метода 2ФП особенно важны для обеспечения культивирования клеток и транспорта питательных веществ в создаваемых матриксах. He менее важным аспектом формирования 3-мерных матриксов для регенеративной медицины является регулирование отношения скоростей формирования живых тканей и скорости биорезорбции синтетических имплантатов. Если скорость роста тканей будет значительно превышать скорость биорезорбции имплантатов, то произойдет резкое замедление процесса регенерации, поскольку новообразованной ткани будет просто некуда расти. В обратном случае произойдет потеря требуемой архитектоники объекта, что, в свою очередь, приведет к гибели тканеобразующих клеток и разрушению формирующегося межклеточного матрикса. Регулирование скорости биодеградации 3-мерных структур обычно достигается использованием различных соотношений сополимеров, входящих в их состав , или точным регулированием размеров стенок и пор. В то же время, на скорость формирования нативной ткани в организме влияет применение биологически активных соединений, например факторов роста.

Наиболее перспективным метод 2ФП выглядит для создания 3-мерных скаффолдов для задач регенерации нервной ткани. Помимо описанных выше общих недостатков методов создания 3-мерных структур (использование органических растворителей, высоких механических и термических нагрузок и т.д.) существуют дополнительные требования, предъявляемы к скаффолдом для восстановления нервной ткани. Известно, что размер пор для таких структур не должен быть слишком маленьким (менее 5 мкм), чтобы нервные клетки могли диффундировать внутрь скаффолда, и не должны быть слишком большими (более 100 мкм), чтобы клетки имели возможность высеваться на поверхность структуры. Большинство традиционных методов формирования 3-мерных структур не позволяют напрямую регулировать размеры пор и их распределение в скаффолде, например, при использовании метода электроспиннинга или метода сублимационной сушки. Метод 2ФП позволяет варьировать заданную структуру и создавать матрицы с шагом 500 нм. Помимо этого, учитывая возможности послойного создания структур, метод 2ФП позволяет менять внутреннею структуру 3-мерных скаффолдов, что особенно важно при направленной регенерации нервной ткани. Помимо этого на настоящий момент существует еще целый ряд недостатков, не позволяющих использовать предлагаемые методы создания структур в практической медицине. Для создания таких структур обычно используются различные синтетические фотополимеризующиеся композиции на основе биосовместимых и биорезорбируюмых полимеров, таких как хитозан, фибрин, гилауроновая кислота и т.д. Одной из наиболее распространенных основ для создания фоточуствительных композиций является полилактид. Основными его преимуществами является средняя скорость биодеградации в ряду полигликолид-полилактид-поликапролактон. В работе было показано, что скорость 50% биодеградации микросфер полилактида, введенных в мышечную ткань лабораторных крыс, составляла 35 недель.

Другими материалами для создания 3-мерных скаффолдов являются композиции, содержащие как фрагменты органических веществ (в большинстве случаев содержащие реакционноспособные двойные связи), так и неорганические молекулы. Такие композиции (гибридные системы) предоставляют возможность использования большого круга фотоинициаторов (большинство из которых растворимы в органических растворителях) для проведения процесса 2ФП. Помимо этого у ряда гибридных структур практически не изменяются заданные линейные размеры после проведения процесса 2ФП, в отличие от композиций описанных ранее. Гибридные материалы обладают целым рядом дополнительных преимуществ, прежде всего удобным синтезом, не требующим специальной подготовки, высоким оптическим качеством исходной системы, химической и электрохимической инертностью, хорошей стабильностью во времени. Так, в работе была проведена сополимеризация алкоксидов кремния и циркония. Полученный материал обладал повышенной механической прочностью. Другим преимуществом гибридных материалов является возможность включения разнообразных функциональных групп с использованием схем синтеза гость-хозяин или боковая цепь — основная цепь. Например, присоединение хромофора, обладающего нелинейно-оптическими свойствами для создания электрооптической системы золь-гель. Например, в работе был осуществлен синтез гибридной системы с помощью процесса золь-гель, содержащей Zr с использованием нижеследующих материалов и этапов синтеза. Метакрилоксипропил триметоксисилан (МОПТМС, 99%, Polyscienceinc.) и метакриловая кислота (МК, 98%, Sigma-Aldrich) были использованы в качестве фотополимеризуемых мономеров. N-пропоксид Zr (ЦПО, 70% в пропаноле, Sigma-Aldrich) и алкоксисилановые группы МОПТМС использовались как части для формирования неогранической матрицы. Различия в реакционной способности алкоксисилановых групп и соли циркония (Zr) предполагают трехстадийный процесс для формирования комбинированных неорганических структур. На первом этапе МОПТМС и ЦПО раздельно гидролизуются и стабилизируются МК. Далее гидролизованный МОПТМС медленно добавляли к комплексу Zr. Гидролиз МОПТМС проводили с использованием 0,01-молярной соляной кислоты в соотношении 1:0,75. Поскольку МОПТМС не смешивается с водой, гидролиз идет в гетерогенной фазе. После 20-минутного перемешивания раствора и добавления метанола гидролиз алкоксисилановых групп был проведен в достаточной мере для перемешивания всех компонентов раствора. Лиганды, обладающие высокой константой комплексообразования, иногда используются для контролирования протекания процесса гидролиза и последующей конденсации для прекурсоров металлов (в основном алкоксидов). В нашем случае в качестве лиганда использовалась МК, которая ковалентно связывалась с комплексом Zr через карбоксил. Для выбранной системы использовалось соотношение 1:1, причем добавление MK осуществлялось постепенно, капельным методом. Реакция проходит с образованием комплекса Zr(ОC3H7)4-x(MK), поскольку используются эквомолярные количества исходных веществ. По прошествии 45 минут частично гидролизованный МОПТМС добавляли к Zr-комплексу. После перемешивания в течении 45 минут к полученной смеси прибавляли воду в соотношении 2,5:5 эквимолярно. На последнем этапе к смеси прибавляли фотоинициатор 4,4’-бис(диэтиламино)бензофенон в расчете 1% масс, по отношению к массе полученного раствора. После перемешивания в течение 24 часов полученный раствор пропускали через мембрану с диаметром пор 22 мкм. Образцы пленок были приготовлены с помощью спин-коутера на стеклянных подложках. После распределения смеси по подложке в течение 12 часов проводился процесс отжига на плитке при температуре 40°С. При нагреве происходит процесс формирования неорганической матрицы.

Структуры были получены на установке 2-фотонной полимеризации с помощью метода прямого лазерного рисования. В работе использовался Ti-сапфи-ровый лазер (Chameleon, Coherent), позволяющий работать в импульсной системе с продолжительностью импульса 140 фс с частотой 80 МГц и пиком излучения на 780 нм. На установке использовался 100-кратный объектив фирмы Karl Zeiss (Na=1,4). После формирования матрикса внутри гибридной системы проводился процесс вымывания непрореагировавшего материала. Для этого использовался изопропиловый спирт. Процесс проводился в течении 12 часов, после чего образцы помещались в этиловый спирт и хранились в нем. Перед высадкой культур клеток на матриксы их выдерживали 48 часов в стерильном натрий-фосфатном буфере.

Трехмерная модель, выбранная для изготовления скаффолдов, представляла собой квадрат со сторонами 2 мм, состоящий из цилиндров со следующими характеристиками: высота 110 мкм, внутренний диаметр 100 мкм, внешний диаметр 160 мкм (рис. 7). Было создано 3 ряда цилиндров, причем средний ряд цилиндров имел смещение относительно нижнего ряда на 80 мкм. Это было сделано для того, чтобы при заселении матриксов клетками, создать внутреннюю опору для дополнительного закрепления клеточного материала. Размеры матрикса были выбраны специально для проведения экспериментов по высаживанию и росту клеток нервной системы.

р7

Помимо создания биосовместимых структур возможности гибридной золь-гель-технологии позволяют создавать 3-мерные структуры, обладающие проводимостью. Известно, что с течением времени в процессе срастания обрубков нервов аксоны при удалении от ближайшего обрубка и органы-мишени, или мышцы, значительно теряют свою способность к регенерации. Поэтому подходы к повышению регенеративной способности нервов являются необходимым условием для полноценного заживления после потери сегмента нервной ткани. Электрическая стимуляция в терапевтических целях на сегодняшний день является наиболее эффективным стимулятором регенеративных способностей, особенно при восстановлении нервной ткани. Существует большое количество работ, описывающих удлинение нейритов и аксонов in vitro и регенерацию нервной ткани in vivo. Так, в ряде работ было показано, что электрическая стимуляция при приложении электрического заряда (постоянного или переменного тока) или при создании электрического поля повышает дифференцировку стволовых клеток, ускоряет рост нервной ткани и непосредственно влияет на рост аксонов. Существует ряд технологий создания токопроводящих биосовместимых материалов, например электрическая стимуляция через электроды обоих концов обрыва нерва, покрытие золотыми наночастицами 3-мерного скаффолда, использование токопроводящих полимеров, таких как полипирол или полианилин.

В работе методом 2-фотонной полимеризации были изготовлены матриксы на основе токопроводящих гибридных золь-гель-систем. В качестве исходного соединения для создания таких систем был использован 3,4-эти-лендиокситиофен (ЭДТ). Основным преимуществом его использования является его биологическая совместимость, оптическая прозрачность, в отличие от других прекурсоров, носителей заряда, которые имеют поглощение в видимой и ближней ИК-области спектра. После проведения окислительной полимеризации ЭДТ был получен проводящий, биостабильный и биосовместимый полимер поли(3,4-этилендиокситиофен) (ПЭДТ). В качестве матрицы для 2-фотонной полимеризации был выбран полиэтиленгликоль-диакрилат (ПЕГ-ДА). Этот материал является биосовместимым и может быть использован совместно с фотоинициатором для создания 3-мерных структур. При этом механические свойства фото-полимеризованного материала ПЕГ-ДА могут быть изменены при выборе различных олигомеров с разными молекулярными массами. В качестве фотоинициатора был выбран водорастворимый Irgacure 2959 (Ciba). В ходе работ были получены биологически совместимые 3-мерные скаффолды с разными процентными соотношениями ПЭГ-ДА и ЭДТ. При повышении концентрации ЭДТ для проведения полимеризации требовалось повышение мощности лазера и времени экспозиции образца. Для проведения процесса 2-фотонной полимеризации использовалась вторая гармоника (520 нм) фемтосекундного иттербиевого лазера femtoTRAIN (High Q Laser Production Gmb Н, Austria) с частотой 20 МГц и продолжительностью импульса 250 фс. Для получения достаточной доли полимеризованого компонента мощность лазера варьировалась от 6,5 до 20,5 мВ.

Для характеристики электрических свойств полученных микроструктур методом 2ФП были получены 3-мерные стержнеподобные тестовые структуры с двумя большими областями контактов и сегмента с размерами 450х50х50 мкм соответственно. Стоит отметить, что изготовление структур на основе систем, содержащих ПЭДТ в количестве более 17%, было невозможно из-за появления видимых деформаций и недостаточной адгезии структур к подложке. На кривой изменения проводимости видно, что с ростом концентрации ЭДТ значительно возрастает проводимость формированной гибридной системы.

Такой рост проводимости объяснялся авторами с помощью теории перколяции, которая связывает повышение проводимости материала с образованием токопроводящих путей. Концентрацию токопроводящего материала, соответствующую порогу перколяции, обычно называют критическим содержанием проводящего материала. Зависимость проводимости этих двухкомпонентных систем хорошо аппроксимируется функцией подгонки Белехрадека:

ф1

где σ — электропроводность, р — содержание проводящего наполнителя, рс — критическое содержание проводящего материала, t — топологический параметр. Топологический параметр характеризует размерность проводящих путей. Исходя из аппроксимации данных на рис. 10 топологический параметр и порог перколяции составили, соответственно, t=1,1 и 5% ПЭДТ. Максимальная проводимость 0,04 См/см достигается при максимальной концентрации ПЭДТ 17% по объему. Таким образом, в работе была показана возможность формирования биостабильных матриксов на основе токопроводящих гибридных систем ПЭГ-ДА/ПЭДТ методом 2ФП. Проводимость такого материала достигала 0,04 См/см при максимальной концентрации ЭДТ 17% об., что дает возможность использовать изготовленные структуры для регенерации нервных тканей.

Таким образом, основным преимуществом метода 2ФП является возможность получения пространственных структур с высоким пространственным разрешением и заданной архитектоникой. Полимеры, которые используются для создания матриксов, могут обладать разными свойствами, в том числе быть проводящими, биодеградируемыми и др. За счет изменения архитектоники метод 2ФП позволяет получать скаффолды, обладающие различными механическим свойствами, изменяемыми в широком диапазоне.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также