Протеолитический процессинг предшественника амилоидного пептида

Уровень содержания APP в клетках и тканях регулируется при помощи его направленного протеолиза под действием специфических ферментов, расщепляющих этот трансмембранный белок с образованием ряда растворимых биологически активных продуктов. В настоящее время выделяют три основные сайта расщепления APP под действием различных ферментов или белковых комплексов, называемых собирательно α-, β- и γ-секретазами. Они способны расщеплять APP с образованием фрагментов разной длины, обладающих определенными функциональными свойствами (рис. 3). В результате действия α- или β-секретаз образуются крупные растворимые белки sAPPα и sAPPβ, играющие важную роль в процессах пролиферации нервных клеток и развитии нервной ткани, и мембраносвязанные фрагменты С83 и С99. В результате действия γ-секретазы на С99 образуется Aβ и короткий цитоплазматический фрагмент AICD, играющий важную регуляторную роль, а при действии на С83 — короткий пептид р3 с неизвестными функциями и AICD, который быстро подвергается протеолитическому расщеплению. Таким образом, катаболизм APP может осуществляться как по амилоидогенному пути в результате действия β- и γ-секретаз с образованием Аβ, так и по неамилоидогенному пути, в котором принимает участие α-секретаза. Этот фермент расщепляет APP внутри последовательности Aβ между лизином и лейцином в положении 16 и 17, соответственно, тем самым предотвращая образование Aβ пептида. Исходя их этого, регуляция (повышение) активности α-секретазы является одним из возможных подходов для профилактики БА. Помимо α-, β- и γ-участков расщепления APP выделяют также сайты, обозначаемые как ε- и δ. В то время как ε-участок находится в непосредственной близости от места действия γ-секретазы, приводя к образованию АРРε, который является субстратом основных секретаз, δ-сайт локализован в районе действия β-секретазы (12 аминокислотных остатков от N-конца Аβ) и также приводит к образованию пептида, склонного к аггрегации. Однако до настоящего времени расщепление APP по этому пути было обнаружено только в гиппокампальных нейронах и не подтверждено другими исследователями. С другой стороны, δ-сайт расположен совсем рядом с недавно обнаруженным участком действия β-секретазы-1 (ВАСЕ1), которая расщепляет APP возле Glull (относительно N-конца на участке Аβ) и продукт расщепления образующегося при этом С-концевого фрагмента APP (АРР89) является субстратом γ-секретазы, высвобождающей неамилоидогенный укороченный Ар-пептид.

В настоящее время известно несколько белков, которым приписывают α-секретазную активность. В основном это цинк-зависимые металлопротеиназы, или адамализины, принадлежащие к семейству ADAM (a disentegrin and metalloprotease), в частности ADAM10 и ADAM17. ADAM17 также известен как ТАСЕ (TNFα-конвертирующий фермент), принимающий участие в секреции фактора некроза опухолей. ADAM9, или MDC9, также обладает α-секретазной активностью. Конститутивный процесс секреции растворимого APP (sAPPα) под действием α-секретазы (см. рис. 3) происходит на поверхности клеток и по этому пути происходит расщепление до 90% всего клеточного APP. В то же время, регулируемая различными факторами, например, холинергическими агонистами мускарином и карбахолом или форболовыми эфирами активность α-секретазы локализуется, в основном, в аппарате Гольджи. Активность α-секретазы ингибируется пептид-гидроксаматами, в частности батимастатом. При умеренной оверэкспрессии белка ADAM10 в нейрональных клетках образование Aβ снижается и формирования сенильных бляшек не наблюдается. Напротив, экспрессия мутантных молекул ADAM10, не способных к протеолизу АРР, приводит к увеличению числа амилоидных бляшек в мозге трансгенных мышей, экспрессирующих мутантный человеческий APP. Трансгенные животные, лишенные гена ADAM10 или ADAM17, являются нежизнеспособными, свидетельствуя о важной роли α-секретазы в жизнедеятельности организма.

Образуемый в результате действия α-секретазы внеклеточный фрагмент sAPPα обладает не только нейропротекторными свойствами, но также свойствами эпидермального фактора роста, а также способствует обучению и памяти. Образование sAPPa посредством активации α-секретазы находится под контролем рецепторов, сопряженных с G-белками, а также таких факторов, как Ерас, регулирующий цАМФ-зависимый обмен гуаниновых нуклеотидов, и ГТФ-аза Rac. Важную роль в регуляции активности α-секретазы также играют ионы железа.

Еще один продукт, образующийся при неамилоидогенном расщепления APP α-секретазой, представляет собой С-концевой фрагмент молекулы APP (С83), состоящий из 83 аминокислотных остатков и являющийся субстратом γ-секретазы (см. рис. 3). При его расщеплении образуется внутриклеточный С-концевой фрагмент APP (AICD) и короткий пептид массой около 3 кДа (р3). Свойства р3 пептидов, состоящих из аминокислотных остатков 17—40 или 17-42 последовательности Аβ, пока не известны. Согласно имеющимся данным, AICD, образующийся по α-секретазному пути, быстро подвергается протеолитическому расщеплению и не вносит существенный вклад в регуляцию генов. В целом, эта часть процесса протеолиза АРР, запускаемого α-секретазой, считается неамилоидогенной и не играющей существенной роли в патологии БA.

Образование Aβ требует участия двух ферментов, именуемых β- и γ-секретазами. В ходе многолетних исследований было показано, что фермент, обладающий β-секретазной активностью, является новым представителем семейства трансмембранных аспартатных протеаз. Этот фермент, получивший название β-site APP-cleaving enzyme, или BACE1 (другие названия Asp2 и мемапсин), инициирует образование Aβ. В литературе описан еще один фермент, гомологичный BACEl и получивший название ВАСЕ2. Этот фермент также обладает β-секретазной активностью по отношению к APP.

BACE1 является трансмембранным белком, состоящим из 501 аминокислотного остатка. Активная форма этого фермента, подобно другим аспартатным протеазам, таким как пепсин и катепсин Д, образуется путем отщепления 23 аминокислотных остатков от неактивной молекулы белка-предшественника. Однако BACE1 отличается от указанных протеаз по вторичной структуре. В литературе описано несколько вариантов посттрансляционных модификаций этого фермента, которые вносят разный вклад в патогенез BA. BACE1 расщепляет APP между метионином и аспартатом в положении 671 и 672, соответственно, в молекуле АРР, состоящей из 770 аминокислот. ВАСЕ2 также способен расщеплять APP на этом участке, а также ближе к С-концевому участку молекулы — в районе тирозина-10 и глутамата-11 внутри последовательности Аβ, что ведет к образованию более короткого варианта Aβ. Как было показано совсем недавно, BACE1 также расщепляет APP на этом участке и, по мнению авторов, в нормально функционирующем мозге этот процесс преобладает. Однако наличие мутаций в молекуле APP или другие патологические воздействия приводят к предпочтительному расщеплению APP с образованием токсичного Aβ. Как было показано в наших исследованиях, нейрональная изоформа APP695 расщепляется преимущественно по β-секретазному пути с образованием Aβ и транскрипционно активного AICD.

С терапевтической точки зрения, BACE1 представляет собой довольно перспективный фермент, поскольку мыши, лишенные гена этого белка, не образуют Aβ и являются жизнеспособными. В связи с этим было предложено несколько подходов для создания эффективных ингибиторов p-секретазной активности у человека в основном с использованием пептидомиметиков, являющихся не превращаемыми аналогами субстратов ВАСЕ. Другой подход предусматривает создание молекул, распознающих BACE1 мРНК и снижающих его экспрессию. Последние включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды, каталитические нуклеиновые кислоты — рибозимы и дезоксирибозимы, а также небольшие интерферирирующие молекулы РНК (siRNAs). Тем не менее, недавно были обнаружены новые эндогенные субстраты ВАСЕ1, что заставляет относиться к созданию ингибиторов этого фермента с определенной осторожностью. В частности, было показано, что BACE1 играет важную роль в функицонироавнии сетчатки и подавление ее активности приводит к ретинопатии.

Весьма неожиданным, но с биохимической точки зрения предсказуемым, было обнаружение того, что активность β-секретазы регулируется конститутивными клеточными белками прионами PrPc, модифицированные формы которых (PrPsc) являются патогенным фактором развития болезней Крейцфельда-Якоба и коровьего бешенства. Это указывает на наличие связи между метаболизмом Aβ и PrPc. В нормальном мозге последние регулируют активность β-секретазы, препятствуя накоплению Ар. Нарушение синтеза PrPc или его конформации в случае болезней Крейцфельда-Якоба или коровьего бешенства ведет к накоплению амилоидного пептида, что также является характерным признаком данных заболеваний. С другой стороны, мутации АРР, приводящие к развитию ювенильной формы БA, также нарушают процесс регуляции BACE1 при участии PrPc, что приводит к усугублению патологии.

Как уже упоминалось выше, вторым ферментом, принимающим участие в образовании Ар, является γ-секретаза, представляющая собой сложный комплекс из нескольких белковых молекул. До сих пор нет окончательного мнения относительно состава и строения γ-секретазы, однако общепринято, что это многокомпонентный комплекс, состоящий из белков пресенилинов 1 и 2 (PS1 и PS2), никастрина (NCT) и белков Aph-1 и Pen-2. Помимо протеолитического расщепления С-концевого фрагмента APP γ-секретазный комплекс принимает участие в недавно открытом, но еще мало понятном пути регулируемого трансмембранного протеолиза (protein RIPing). Компонент γ-секретазы PS1 также принимает участие в протеолитическом расщеплении сигнальных молекул Notch, играющих важную роль в развитии ЦНС.

Белки пресенилины были открыты в ходе скрининга генетических мутаций, ведущих к формированию ювенальной формы БА. Пресенилины вместе с протеазами сигнальных пептидов (SPP) представляют собой новый класс протеаз, являющихся интегральными мембранными белками, в основе деятельности которых лежат каталитические свойства классических аспартатных протеиназ, таких как пепсин, ренин и катепсин Д. Характерной чертой пресенилинов и протеаз сигнальных пептидов является их способность расщеплять полипептидные субстраты внутри трансмембранного домена. Это требует присутствия в каталитическом участке молекул этих ферментов двух соседствующих остатков аспартата и консервативного Про-Ала-Лей мотива в С-концевой части их молекул. Именно пресенилины, как было подтверждено рядом авторов, являются каталитическими субъединицами мультипротеинового комплекса, который проявляет γ-секретазную активность. Клеточные и молекулярно-биологические исследования показали, что пресенилины и их гомологи имеют 9 трансмембранных доменов, а недавно полученная кристаллическая структура этого белка представляет платформу для выяснения субстратной специфичности этих ферментов и создания их ингибиторов.

В физиологических условиях APP может расщепляться не только внутри его трансмембранного домена, но также на цитоплазматическом участке, близком к плазматической мембране, с образованием С-концевого фрагмента С50 и более длинного фрагмента APPε, который, в свою очередь, является субстратом α- и β-секретаз, а также γ-секретазы. Как было показано, расщепление APP на γ- и ε-участках представляет собой два независимых процесса, которые регулируются разными механизмами. При БA имеет место достоверное снижение ε-секретазной активности.

В результате действия γ-секретазы на С99 фрагмент APP образуется набор Aβ пептидов, содержащих 40, 42 или 43 аминокислотных остатка, что предполагает тем самым существование нескольких сайтов расщепления. Тем не менее, Aβ40 образуется в наибольшей концентрации, в то время как Aβ41 является более токсичным, менее растворимым и с большей готовностью образует конгломераты. Исследования мембранной топологии убедительно показали, что мутации APP в районе трансмембранного домена драматически изменяют соотношение Аβ40/Аβ42 в сторону образования высоких концентраций более токсичной формы Aβ42. Механизм, в результате которого мутации в молекуле APP и пресенилинов ведут к гиперпродукции более длинных изоформ Аβ, пока еще не известен, но в данном направлении ведутся довольно многочисленные исследования.

Недавно было показано, что активность γ-секретазы находится под контролем β-аррестина 2, принадлежащего к классу соединений, контролирующих многочисленные функции рецепторов, связанных с G-белками. Так, при развитии БA аррестин 2 непосредственно связывается с Aph-1, приводя к предпочтительному распределению γ-секретазного комплекса в липидные домены клеточных мембран, обогащенные сфинголипидами и холестерином, где происходит амилоидогенное расщепление APP и образование Аβ. Это ведет к повышению концентрации последнего и усугублению патологии.

Несмотря на то что создание ингибиторов γ-секретазного комплекса для предотвращения формирования Aβ и развития БA является весьма привлекательным теоретическим подходом, он имеет определенные ограничения, поскольку мыши, лишенные обеих аллелей гена PS-1, погибают, демонстрируя существенную патологию развития. Более того, ингибиторы γ-секретаз также приводят к патологии развития вследствие нарушения сигнальных процессов, осуществляемых посредством рецепторов Notch. Это диктует необходимость направленного поиска способов ограничения протеолиза APP при участии γ-секретазы, которые бы не затрагивали процессинг Notch рецепторов.

В апоптотических клетках и в мозге больных деменцией альцгеймеровского типа APP помимо секретаз может также подвергаться альтернативному протеолизу под действием каспазы-3 и каспазы-8. Расщепление под действием каспаз происходит внутри цитоплазматического домена молекулы APP в районе аспартата 664 (в молекуле АРР, состоящей из 695 аминокислотных остатков). Продукты протеолиза APP каспазами являются очень токсичными. В нормально функционирующих клетках есть механизм защиты APP от действия каспаз посредством фосфорилирования остатка аминокислоты треонина в положении 668 молекулы APP. Изменение характера фосфорилирования APP и повышение его чувствительности к каспазам рассматривается как один из факторов патогенеза БA. При определенных условиях каспазы также расщепляют цитоплазматический фрагмент APP (AICD), который принимает участие в регуляции экспрессии ряда генов, о чем более подробно будет изложено в последующих разделах данной главы.

Протеолитический процессинг АРР, как было показано в многочисленных исследованиях, происходит в так называемых липидных рафтах, которые представляют собой специализированные домены клеточных мембран, обогащенные холестерином и ганглиозидами, в частности GM1. Эти домены играют важную роль в функционировании клеток, обеспечивая такие функции, как связывание лигандов (включая вирусы и олигомеры Аβ) и передача сигналов, развитие аксонов и поддержание целостности синаптических окончаний. Именно на этих участках происходит взаимодействие APP и BACE1 и инициируется процесс образования Аβ. Нарушение целостности этих мембранных структур приводит к клеточной гибели и нейродегенерации. В связи с этим модификации липидного состава нервной ткани являются одними из важных факторов, влияющими на амилоидный метаболизм и развитие БA.

Помимо процессов расщепления АРР, которые вносят свой вклад в патогенез БA, существенную роль в определении амилоидного метаболизма также играют процессы транскрипции и трансляции гена АРР, которые приводят к формировании его изоформ, а также генов его основных секретаз. В недавних исследованиях было показано наличие корреляции между уровнем накопления в нерастворимых белковых комплексах, характерных для БA и других нейродегенеративных заболеваний, коротких ядерных рибонуклеобелков (U1 snRNP), принимающих участие в сплайсинге молекул мРНК, и уровнем развития когнитивного дефицита на стадии MCI и БA. Авторы высказывают прпедположение, что дефицит активности этих U1 snRNP комплексов приводит к нарушению нормального сплайсинга мРНК и накоплению неспецифических для нервных клеток изоформ белков, в частности APP и BACE1. С другой стороны, становится все более очевидным, что короткие некодириующие микро-РНК (miR) также обеспечивают контроль за синтезом APP и других белков, вовлеченных в патогеенез БA, и эти процессы могут быть нарушены или изменены при патогенезе БА. Так, в частности, была показана роль miR-29a/b в синтезе BACE1 и расщеплении APP. В целом, молекулы miR в настоящее время рассматриваются как возможные маркеры БА.