Природа флуорофоров, ответственных за аутофлуоресценцию глазного дна

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

Как известно, фотолиз зрительного пигмента родопсина завершается разрывом ковалентной связи между опсином и полностью-транс-ретиналем (ПТР) и высвобождением последнего из хромофорного центра опсина. ПТР высвобождается во внутридисковое пространство фоторецепторного диска наружного сегмента зрительной клетки. Затем он переносится через фоторецепторную мембрану на цитоплазматическую поверхность диска, где восстанавливается до полностью-транс-ретинола высокоактивной ретинолдегидрогеназой. В свою очередь, полно-стью-транс-ретинол переносится при помощи ретинол-переносящих белков из наружного сегмента палочки в клетку РПЭ.

При патологии, когда белок-переносчик дефектен, например при болезни Штаргардта (дефектным является белок-переносчик ABCR4), ПТР накапливается в фоторецепторной мембране.

При избыточном обесцвечивании родопсина в фоторецепторной мембране также может происходить накопление ПТР Свободный и неудаленный из фоторецепторной мембраны ПТР может легко взаимодействовать с аминогруппой фосфатидилэтаноламина с образованием основания Шиффа — N-ретинилиден-фосфатидилэтаноламина (АРЕ). Именно этот продукт взаимодействия ПТР с фосфатидилэтаноламином удаляется из фоторецепторной мембраны при помощи АТФ-зависимого белка-переносчика (ABCR).

Неудаленный APE может вступать во взаимодействие еще с одной молекулой ПТР, приводя к образованию бисретиноидов, в том числе таких побочных и потенциально опасных продуктов, как N-бис-ретинилиден-фосфатидилэтаноламин — А2-РЕ (N-bis-retinylidene-phosphatidylethanolamine), дигидро-А2-РЕ, основания Шиффа между димером ПТР и фосфатидилэтаноламином — ATR-dimer-PE (ATR-dimer-phosphatidylethanolamine conjugate). При взаимодействии двух молекул ПТР с аминогруппами белка (родопсина) может образовываться А2-родопсин. Все эти побочные продукты являются устойчивыми соединениями, и они представляют собой источник накопления бисретиноидов в фоторецепторной клетке.

В то же время, сам ПТР является эффективным природным фотосенсибилизатором. По механизму фотосенсибилизированного окисления ПТР способен окислять и белки, и липиды в фоторецепторной мембране. Показано, что он способен повреждать родопсин, межфоторецепторный ретинол-связывающий белок, а также мембранный белок-переносчик ABCR.

До недавнего времени считалось, что при физиологических условиях накопление токсичного и фототоксичного свободного ПТР в наружном сегменте зрительной клетки или не происходит, или является кратковременным. Однако совокупность накопленных к настоящему времени данных свидетельствует о том, что ПТР способен выступать в роли токсического или фототоксического агента, усугубляющего развитие дегенеративных заболеваний сетчатки. Другими словами, накопление в фоторецепторных клетках свободного ПТР может рассматриваться как фактор риска усугубляющего действия света при развитии различных дегенеративных заболеваний сетчатки.

В процессе эволюции зрительной системы сформировался достаточно эффективный способ защиты от накопления в клетке молекулярных дефектов и, в том числе, побочных продуктов фотолиза родопсина — бисретиноидов. Постоянное обновление фоторецепторных мембран и всего наружного сегмента зрительной клетки (и палочки, и колбочки) позволяет в норме избегать накопления молекулярных дефектов, благодаря чему молекулярная «машинерия» зрения остается эффективной на протяжении всей жизни. Однако вместе с т.н. фагосомами — «отработанными» и фагоцитированными обломками наружных сегментов фоторецепторных клеток, в клетки РПЭ попадают и (фото)токсичные бисретиноиды. В результате неполной лизосомальной деградации фагосом в клетках РПЭ накапливаются недеградабельные ЛГ — «пигмент старости».

Долгое время ЛГ считались инертным побочным продуктом жизнедеятельности клетки РПЭ. Однако, во-первых, была показана способность ЛГ генерировать при действии видимого света активные формы кислорода и, во-вторых, выявлена явная корреляция между накоплением ЛГ в клетках РПЭ и дегенеративными заболеваниями сетчатки, в том числе ВМД. He вызывает сомнения, что производные ПТР — бисретиноиды, являются фототоксичными для клеток РПЭ и что их окисленные формы становятся токсичными и в темноте.

ЛГ поглощают свет в видимой, в основном коротковолновой (фиолетово-синей), области спектра, и обладают ярко выраженной флуоресценцией. Флуоресцентные свойства ЛГ обусловлены, в основном, наличием в них конъюгатов ПТР различной природы. Однако хорошо изученным является практически только один флуорофор, т.н. А2Е (N-ретинил-К-ретипилидепэтаполамии) — продукт взаимодействия двух молекул ПТР с аминогруппой одного из липидов фоторецепторной мембраны — фосфатидилэтаноламина (PE). А2Е образуется из своего предшественника А2РЕ путем ферментативного гидролиза (рис. 1). Помимо А2Е в ЛГ содержится еще около двадцати флуорофоров, являющихся производными ретиналя. В настоящее время охарактеризованы такие конъюгаты ПТР, как ПТР-димер (ATR-dimer), ПТР-димер этаноламин конъюгат (ATR-dimer-E), ПТР-димер фосфатидилэтаноламин конъюгат (ATR-dimer-PE), А2-дигидропиридин-фосфатидилэтаноламин (A2-DHP-PE) и А2-дигидропиридин-этаноламин (А2-DHP-E), а также конъюгат ПТР с глицерофосфоэтаноламином (glycerophosphoethanolamine) (A2-GPE).

р1

В присутствии кислорода А2Е может фотоокисляться с образованием различных окисленных форм. Окисленные продукты А2Е способны оказывать токсическое действие на клеточные структуры уже без участия света. Эти продукты окисления являются более гидрофильными, чем исходный А2Е. Поэтому они могут высвобождаться из ЛГ и перемещаться в цитоплазме клетки РПЭ в другие клеточные органеллы, например в ядро и в митохондрии РПЭ. Окисленные формы А2Е были обнаружены в ЛГ, выделенных как из старческих глаз человека, так и из РПЭ глаз мышей с мутацией в ABCR-гене, моделирующем болезнь Штаргарда и ВМД. При этом были идентифицированы в РПЭ как мышей, так и человека обе формы продуктов окисления А2Е — эпокси- и фуранопроизводные. Важно подчеркнуть, что образование и накопление окисленных продуктов отражается на спектральных характеристиках ЛГ. Как нами ранее было показано, при действии света (фотоокислении) спектры поглощения и флуоресценции как А2Е, так и самих ЛГ сдвигаются в коротковолновую область. Очевидно, что неокисленные и окисленные формы флуорофоров могут вносить различный вклад в картину аутофлуоресценции глазного дна, что следует учитывать при дальнейшем усовершенствовании этого метода.

Изучение состава и спектральных характеристик флуорофоров, их неокисленных и окисленных форм, содержащихся как в ЛГ клеток РПЭ, так и в фоторецепторных клетках сетчатки, является важным как для понимания природы, так и для интерпретации картины аутофлуоресценции глазного дна, меняющейся в ходе старения и на различных стадиях патологического процесса. Такое изучение важно независимо от того, возбуждается АФ при 488 нм или регистрируется в диапазоне 500-600 нм, как это имеет место в существующем гейдельбергском офтальмоскопе, и это тем более важно, если в будущем удастся получать картину АФ при более коротковолновом возбуждении и более коротковолновой регистрации.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также