Применение аденозинфосфатов для предотвращения молекулярного старения NADH-дегидрогеназы в митохондриях

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

Нейродегенеративные процессы в мозге приводят, в частности, к паркинсонизму. Старческий паркинсонизм с трудом поддается лечению. Применение различных медикаментов помогает на время снять симптомы, но не более того. Например, дофаминовая терапия не позволяет вылечить паркинсонизм. Поэтому необходимы новые подходы, которые могли бы позволить осуществлять эффективное лечение.

Один из путей лечения, на наш взгляд, мог бы заключаться в восстановлении функции стареющих митохондрий. Ведь старение митохондрий может приводить к дегенерации нейронов. Старые митохондрии — постмитохондрии — характеризуются ухудшением работы дыхательной цепи, снижением продукции АТФ, появлением липофусцина.

В последние годы старческое развитие нейромышечных дегенеративных заболеваний все чаще связывают с нарушениями работы NADH-дегидрогеназного комплекса I в митохондриях и, как следствие, повышенным окислительным стрессом клеток.

Мы предполагаем, что одним из факторов, вызывающим эти нарушения, является потеря связи между FMN и NADH-дегидрогеназой.

FMN находится в 50-кДа субъединице NADH-дегидрогеназы (именно эта субъединица имеет активный центр для связывания NADH). FMN связан с ферментом нековалентно и поэтому при различных воздействиях легко выпадает. Это может происходить спонтанно с течением времени, при небольшом повышении температуры, под действием следовых количеств (0,001%) детергентов и других вредных факторов. В результате электроны от NADH не идут далее по электрон-транспортной цепи, а напрямую восстанавливают молекулярный кислород до супероксида. Перепроизводство супероксид-аниона, способного приводить к перекисному окислению липидов, к повреждению белков и ДНК, вызывает неизбежное старение как самих митохондрий, так и других клеточных органелл. В ходе этого может запускаться механизм гибели клетки путем апоптоза или некроза, в зависимости от количества и степени повреждения митохондрий.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что предотвратить потерю связи между NADH-дегидрогеназой и молекулой FMN можно с помощью NAD, который стабилизирует собой фермент. Такое действие NAD вызвано, во-первых, тем, что он, являясь продуктом окисления NADH, ингибирует реакцию дегидрирования и, во-вторых, находясь в активном центре, механически стабилизирует активный центр, что препятствует вываливанию FMN. К сожалению, возможное лечение митохондриальных энцефаломиопатий с использованием NAD затруднительно, так как он плохо проникает в клетки и в сами митохондрии. Кроме того, NAD может тормозить работу NADH-дегидрогеназы, алко-гольдегидрогеназы и других NAD-зависимых ферментов.

Своей задачей в этой работе мы поставили протестировать некоторые природные аналоги NAD на предмет стабилизации FMN в NADH-дегидрогеназе, причем, что особенно важно, без подавления ферментативной активности. Для этого был выбран ряд природных веществ с похожей на NAD химической формулой: АТР, ADP, АМР, аденин, аденозин, никотиновая кислота и никотинамид.

Чтобы увеличить спонтанный выход FMN, изолированные митохондрии инкубировались при температуре 37°С в течение двух часов. Для того чтобы такие вещества, как NAD, NADH, аденин и аденозин, лучше проникали в митохондрии, была выбрана гипотоническая среда инкубации, содержащая 100 мМ сахарозы и 10 мМ Tris-фосфат, рН=7,0. В такой среде митохондриальные мембраны становятся более проницаемыми. Кроме того, митохондрии использовались после однократной заморозки, что способствует некоторой пермеабилизации мембран и лучшему проникновению веществ (но не разрушает самих органелл).

Для определения ферментативной активности NADH-дегидрогеназы был выбран фотометрический метод Беляковича с помощью пара-нитротетразолия фиолетового (p-NTV), восстанавливающегося до формазана, который откладывается в матриксе митохондрий в виде микрокристалликов и не влияет на дальнейшую скорость реакции. Кроме того, этот метод удобен тем, что скорость восстановления p-NTV в десятки раз превосходит скорость передачи электронов по электрон-транспортной цепи на кислород, поэтому можно не использовать блока-торы дыхательной цепи.

Митохондриальную фракцию из печени крыс выделяли в среде, содержащей 20 мМ Tris-HC1 и 250 мМ сахарозы (рН=7,7), при температуре 2°С стандартным методом с некоторыми модификациями. Сначала центрифугировали исходную общую суспензию на BECKMANJ2-21 при 1000 g в течение 10-15 мин, в результате чего осаждались (и затем отбрасывались) клетки и другие крупные частицы. Супернатант центрифугировали в течение 15 мин при 5000 g, в результате чего осаждались в основном зрелые тяжелые митохондрии, которые затем суспендировали в той же среде (9 мл на 1.5 мл осадка), расфасовывали на льду в пробирки Eppendorf по 1 мл, замораживали и использовали для опытов (после размораживания). В ряде случаев выделение митохондрий производили в среде, содержащей 200 мМ сахарозы, 100 мМ маннит, 10 мМ хепес (рН=7,5), и осуществляли двойную промывку с двукратным центрифугированием при 5000 g.

Ферментативная реакция окисления NADH паранитротетразолием фиолетовым (p-NTV) детектировалась по образованию формазана, откладывающегося внутри митохондрий. В ходе ферментативной реакции окисления NADH молекула p-NTV восстанавливается до формазана, и суспензия митохондрий приобретает из-за него розовую окраску. В этих опытах к суспензии митохондрий из печени крысы добавляли 100 мкМ NADH, 100 мкМ p-NTV и тестируемое вещество (ADP, аденозин и др.) в избытке (до 300 мкМ). Кинетику увеличения оптической плотности при образовании формазана измеряли в течение 15 минут на спектрофотометре «ПромЭкоЛаб-5400УФ» (Санкт-Петербург) при 540 нм.

Концентрацию митохондриального белка определяли УФ-экспресс-методом (Векшин, 1988). Все фракции выравнивали по содержанию белка с помощью буфера (100 мМ сахарозы и 10 мМ Tris-фосфат, рН=7,0) до конечной концентрации 0,3 мг/мл.

Спектры флавиновой флуоресценции митохондрий записывали на спектрофлуориметре SLM-4800 (SLM, Inc., США) в 1-сантиметровой или 0,4-сантиметровой кюветах при 20°С. Длина волны возбуждения флавинов была в максимуме полосы поглощения при 450 нм, а длина волны излучения — в максимуме при 525 нм. В ряде опытов, где интенсивность флуоресценции была низкой, в частности — при измерении степени поляризации (P) флавиновой флуоресценции, использовали зеркальные кюветы, позволяющие усилить сигнал в несколько раз.

Для обнаружения локализации флавина после 2-часовой инкубации при 37°С раствор митохондрий пропускался через 0,2-микронные миллипоровые фильтры и затем проводилось измерение флуоресценции фильтрата (митохондрии оседали на фильтре). Через такие поры проходят помимо флавинов и флавобелков также протомитохондрии (малые зародышевые незрелые митохондрии), но они почти не содержат флавинов. В других измерениях, где митохондрии не мешали измерению флавиновой флуоресценции, они не удалялись из раствора. Все измерения проводились по 5-10 раз на митохондриальных фракциях из разных животных, затем находилось среднеарифметическое значение, которое затем нормировалось на 100%.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что процесс выхода FMN из активного центра NADH-дегидрогеназы может ускоряться некоторыми веществами, в частности — следовыми количествами детергентов, а также небольшим длительным нагреванием. Это согласуется с давно известным фактом полной или частичной утраты FMN в ходе препаративных работ по выделению и очистке изолированной NADH-дегидрогеназы. Причем утрата FMN сопровождается падением NADH: убихинон-редуктазной активности, но не NADH: феррицианид-редуктазной. Это связано с тем, что FMN во второй реакции не участвует. He участвует он и в NАDН:тстразолий-редуктазной реакции.

В наших экспериментах по стабилизации флавиновых молекул в ферменте мы инкубировали митохондрии в течение 2 часов при 37°С. После этого при 20°С измеряли флавиновую флуоресценцию (λвозб=450 нм, λэмисс=525 нм). Кроме того, мы измеряли триптофановую флуоресценцию (λвозб=286 нм, λэмисс=340 нм) — для определения выхода из митохондрий белков (большинство белков митохондрий содержат триптофановые остатки) и флуоресценцию 7-амино-актиномицина (λвозб=530 нм, λэмисс=620 нм) — для определения выхода ДНК в раствор (7-амино-актиномицин хорошо встраивается в расплетенные участки ДНК) (Векшин, 2009). Оказалось, что в процессе выхода FMN не происходит никакого выхода белков и ДНК из митохондрий в раствор: интенсивность триптофановой флуоресценции и 7-амино-актиномициновой флуоресценции в среде после 2-часовой инкубации митохондрий (при 37°С) и их последующего удаления оставалась пренебрежимо малой (данные не приводятся). Это означает, что митохондриальные мембраны остались целыми.

При этом интенсивность флавиновой флуоресценции в контрольных пробах при инкубации возрастала в 2-3 раза (в разных опытах, в зависимости от сохранности митохондрий). Нужно отметить, что вклад в общую флавиновую флуоресценцию митохондриальной суспензии дает не только FMN, принадлежащий NADH-дегидрогеназе, но и флавинадениннуклеотиды (FAD), прочно ковалентно связанные с другими митохондриальными дегидрогеназами. Изменение же интенсивности флавиновой флуоресценции обусловлено в основном именно выходом FMN из NADH-дегидрогеназы в раствор (за счет выхода FMN из митохондрий возрастает его коэффициент экстинкции, а значит и флуоресценция). Молекулы FAD митохондриальных флавопротеинов не вносят заметного вклада в изменение флуоресценции, потому что молекулы FAD остаются связанными ковалентно со своими ферментами внутри митохондриальных сфер, рассеивающих падающий на них свет. К тому же, флуоресценция FAD затушена ароматическими аминокислотами и железо-серными кластерами.

Помимо регистрации изменений интенсивности флуоресценции мы измеряли степень поляризации флавиновой флуоресценции, по величине которой можно определить, в каком состоянии находится FMN — связанном или свободном. У связанного флавина степень поляризации высокая (из-за малого времени жизни возбужденного состояния и низкой вращательной подвижности внутри белка). По мере выхода FMN в раствор степень поляризации уменьшается, т.к. в водной фазе резко увеличивается скорость вращения, а также увеличивается время жизни (из-за отсутствия тушения железо-серными кластерами). В наших опытах степень поляризации флавиновой флуоресценции после инкубации при 37°С через 2 часа уменьшалась в 1,5-2 раза.

Для того чтобы проверить, где именно оказался высвобожденный FMN — в митохондриальном матриксе или внешнем растворе — мы измеряли интенсивность и степень поляризации также в фильтратах, полученных путем фильтрации суспензий митохондрий (до и после 2-часовой инкубации) через 0,2-микронные миллипо-ровые фильтры. Интенсивность флуоресценции в фильтрате увеличивалась после инкубации митохондрий (в сравнении с митохондриями до инкубации) в 4,3 раза. Это составило 94% от общей интенсивности флуоресценции после инкубации. При этом степень поляризации флуоресценции в фильтрате снижалась очень сильно -до 0,06, что соответствует свободному вращению FMN в водной фазе. Полученные данные однозначно говорят о том, что почти весь FMN попадает во внешний раствор, причем в свободном виде. Молекулы FMN, отошедшие в NADH-дегидрогеназе от железо-серных кластеров (которые тушили флуоресценцию FMN) и вышедшие из фермента в матрикс (но не успевшие выйти в наружный раствор), дают в изменение интенсивности небольшой вклад.

Нужно особо подчеркнуть, что в наших опытах изменения флавиновой флуоресценции не связаны с процессами окисления/восстановления флавинов, т.к. двухчасовая инкубация митохондрий в большинстве экспериментов осуществлялась в отсутствие NADH, сукцииата и иных восстановителей или окислителей. Только в одном случае — при использовании NADH в ходе инкубации — имели место одновременно два явления: восстановление FMN до нефлуоресцирующего FMN-H2 и стабилизация FMN в ферменте. Поскольку восстановленный флавин (FMN-H2) имеет разрыхляющие орбитали и не стабилен (сразу отдает электроны в дыхательную цепь, на убихинон), то он быстро переходит вновь в свою окисленную флуоресцирующую форму. Таким образом, вряд ли редокс-переходы FMN/FMN-H, вносят ощутимый вклад в изменения флавиновой флуоресценции.

Мы протестировали ряд веществ с частично похожей на NAD химической формулой: аденин, аденозин, ATP, ADP, АМР, никотиновая кислота, никотинамид, NAD.

Начнем с аналогов адениловой части кофемента: аденин, аденозин, ATP, ADP, AMP.

р1

При добавлении ATP, ADP или AMP в концентрации 300 мМ к суспензии печеночных митохондрий флавиновая флуоресценция изменялась, соответственно, на 44,8%, 49,4% и 41% меньше по сравнению с контролем (рис. 1, табл. 1). При добавлении 300 мкМ AMP к 0,1 мкМ FMN, растворенного в воде (без митохондрий), интенсивность флавиновой флуоресценции не изменялась, т.е. комплексообразование FMN с тестируемыми веществами отсутствовало. Нужно заметить также, что AMP действовал на флавиновую флуоресценцию митохондрий даже в 10-кратно меньшей концентрации — 30 мкМ, причем не хуже, чем 300 мкМ, что говорит о довольно высокой константе связывания этой молекулы с NADH-дегидрогеназой.

Степень поляризации флавиновой флуоресценции при добавлении ATP, ADP и AMP по сравнению с контролем была больше в 2 раза, 1,9 раза и 1,8 раза, соответственно (рис. 2, табл. 2). Это свидетельствует о том, что в присутствии указанных веществ молекулы FMN в основном оставались связанными с молекулами фермента.

р2

Также мы изучали, как влияют указанные вещества на ферментативную реакцию окисления NADH. На рис. 3 показана кинетика NADH-тетразолиевой реакции в течение 15 минут. Видно, что сильных отклонений от хода реакции по сравнению с контролем практически нет. Причем AMP даже ускорял реакцию. Следовательно, можно сделать вывод, что данные вещества (ATP, ADP и АМР) не подавляют ферментативную активность NADH-дегидрогеназы (табл. 3). В использованных концентрациях они не конкурируют с NADH за активный центр.

р3

При добавлении аденина или аденозина в концентрации 300 мкМ к суспензии печеночных митохондрий изменения флавиновой флуоресценции и степени поляризации флавинов (см. табл. 1, 2) по сравнению с контролем были мало выражены. И эти вещества не влияли на ферментативную активность NADH-дегидрогеназы (см. табл. 3).

Вторая группа аналогов NADH включает в себя никотиновую часть молекулы. Мы протестировали такие вещества, как NAD, NADH, никотиновую кислоту и никотинамид. Из табл. 1 видно, что NAD и NADH препятствуют выходу молекулы FMN, но не настолько хорошо, как AMP, ADP или ATP.

NAD в большой концентрации (2 мМ) успешно конкурирует с NADH за активный центр. Поэтому он полностью ингибирует процесс образования формазана. А в концентрации 300 мкМ он снижает реакцию лишь на 20% (см. табл. 3).

Ряд исследователей утверждают, что в NADH-дегидрогеназе есть два центра связывания (рис. 4). Предполагается, что в первом происходит окисление NADH, во втором — восстановление NAD. Такие аналоги NAD, как ATP, ADP и АМР, могут связываться со вторым центром, стабилизируя его и механически не давая молекуле FMN выйти из белка в раствор (первый центр занят молекулой NADH или NAD). Несмотря на свой небольшой, по сравнению с NAD, стерический размер, адениловые нуклеотиды в концентрации 300 мкМ не конкурируют за центр связывания с NADH — не ингибируют NADH-тетразолиевую реакцию (см. табл. 3). Интересно, что в случае с AMP эта реакция даже ускоряется (до 30%), что может говорить об аллостерическом регулировании фермента. В присутствии других аналогов скорость данной реакции не отличается от контроля. Очевидно, что адениловые нуклеотиды взаимодействуют либо со вторым центром, либо, что более вероятно, у них есть свой собственный центр связывания с NADH-дегидрогеназой.

р4

Судя по изменениям интенсивности флавиновой флуоресценции, действие NAD меньше на 23% по сравнению с контролем, что в среднем на 21% меньше, чем у ATP, ADP и AMP Самая высокая степень поляризации флуоресценции FMN в белке наблюдается в присутствии NAD — на 13% больше, чем в случае с ATP (при концентрациях 300 мкМ).

Нужно отметить, что при измерении интенсивности и степени поляризации флуоресценции флавинов в присутствии NADH необходимо учитывать, что в непользованной концентрации NADH в воде образует димеры, которые, возбуждаясь при 450 нм, флуоресцируют в той же области, при 525 нм, что и FMN (данные не приводятся). При концентрации 300 мкМ димеры NADH дают вклад около 50% в общую интенсивность. Некоторые исследователи ранее ошибочно принимали флуоресценцию димеров NADH за флавиновую флуоресценцию. За вычетом вклада димеров NADH интенсивность флуоресценции FMN в присутствии NADH на 45% больше по сравнению с контролем. Такая же разница с контролем — у ATP, ADP и АМР, в среднем — 45%.

При добавлении никотинамида или никотиновой кислоты в концентрации 300 мкМ к митохондриям наблюдается увеличение флавиновой флуоресценции на 39% и на 33%, соответственно, по сравнению с контролем. При этом степень поляризации флавиновой флуоресценции в случае применения никотинамида и никотиновой кислоты мало отличаются от контроля. Можно сделать вывод, что эти вещества практически не защищают NADH-дегидрогеназу от потери флавина (см. рис. 1, 2). На реакцию окисления NADH они также не влияют (см. табл. 3).

Подводя итоги, можно заключить, что аденозинфосфаты (ATP, ADP и АМР) способны эффективно препятствовать выходу FMN из NADH-дегидрогеназы, причем не хуже, чем NAD и NADH. Они гидрофильны, хорошо проникают в клетки и митохондрии. Как известно, клетки обычно поддерживают соотношение между ATP и ADP постоянным, а содержание AMP может заметно варьировать. Введение избыточных количеств одного из аденозинфосфатов при лечении не вызовет нарушения их внутриклеточного баланса, но может на время акативировать аденозинфосфат-зависимые ферментативные реакции. He случайно AMP и ATP применяются в настоящее время в спортивной медицине, а также для лечения мышечной дистрофии, хронической коронарной недостаточности, дистрофии миокарда. Поэтому в принципе можно начать их доклинические испытания на предмет лечения энцефаломиопатий.

Кроме того, важно будет провести в дальнейшем для лечения и профилактики митохондриального старения и нейродегенеративных заболеваний исследования по поиску и разработке аналогичных синтетических препаратов.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также