Поиск первичной мишени пептида TGENHR-NH2 и ex vivo анализ изменения рецепторных характеристик мозга при его введении

Ранее в многочисленных экспериментах было показано, что пептид HLDF-6 обладает высокой ноотропной и нейропротекторной активностью, однако механизм психо- и нейротропного действия данного пептида остается, в основном, нераскрытым. В связи с этим была изучена роль рецепторов, предположительно контролирующих уровень исследовательской активности и тревожности. Был проведен поиск предполагаемых мест специфического связывания пептида TGENHR-NH, и исследовано изменение рецепторных параметров мозга при его субхроническом системном введении. Специфическое связывание пептида исследовали методом радиолигандного анализа in vitro на мембранах мозга крысы с использованием меченного тритием пептида [3H]TGENHR-NH2, а влияние субхронического системного введения пептида TGENHR-NH, исследовали методом ex vivo анализа изменения плотности глутаматных, никотиновых и серотониновых рецепторов на мембранах префронтальной коры и гиппокампа мозга мышей инбредных линий С57В1/6 и Balb/c, применяя меченные тритием селективные лиганды к этим рецепторам.

В экспериментах по поиску предполагаемых мест специфического связывания пептида HLDF-6 за основу был взят метод, описанный в работе, посвященной поиску специфических мест связывания для пептида Семаке в модификациях. Крыс линии Вистар (самцы) декапитировали, извлеченный мозг промывали и гомогенизировали в 10 объемах 10 мМ Трис-HCl буфера, рН=7,4, содержащего 0,32 M сахарозу, 1 мМЭДТА, 1 мМ бензамидин и 0,1 мМ фенилметил-сульфонилфторид (буфер 1). Гомогенизацию и все последующие операции проводили при температуре 40°С. Гомогенат центрифугировали в течение 20 мин при 1000 g, и супернатант подвергали повторному центрифугированию при 40 000 g в течение 30 мин. Плотный коричневый осадок на дне пробирки, обогащенный митохондриями, отбрасывали, а менее плотный светлый осадок суспендировали в буфере 1, переносили в чистую пробирку и дважды промывали этим буфером, осаждая мембраны центрифугированием, аналогичным предыдущему. По окончании промывок осадок суспендировали в 10 мМ Трис-HCl, рН=7,4, содержащем

0,22 M сахарозу и 1 мг/мл БСА, и хранили в жидком азоте. Концентрация белка для хранения, определенная по модифицированному методу Лоури, составляла 5-10 мг/мл.

Исследуемый пептид TGENHR-NH7 в диапазоне концентраций от 10в-4 до 10в-9 M не обнаружил эффекта конкуренции с меченным [3H]TGENHR-NН, за предполагаемые рецепторные места связывания как при времени инкубации — 15 минут, так и при инкубации в течение 60 минут. Вариации pH среды инкубации (6.5, 7.4 и 8.0) также не способствовали выявлению специфического связывания лиганда на мембранах. В этом году получен только небольшой объем предварительных данных, которые необходимо существенно дополнить, для того чтобы прийти к определенным выводам о первичной мишени гептапептида TGENHR-NH2 на мембранах головного мозга.