Новые лиганды Cys-петельных рецепторов и путь к лекарствам

Необходимость детекции и воздействия на отдельные подтипы нАХР определяет необходимость поиска и создания новых высокоаффинных и селективных лигандов. Основой служат многочисленные известные соединения, взаимодействующие с разными участками нАХР: агонисты, конкурентные антагонисты, блокаторы ионного канала, а также разнообразные модуляторы холинергической активности. Такое разнообразие, то есть способность связывать различные классы соединений, служит вероятным объяснением участия нАХР в самых различных физиологических процессах. Хорошо известно, что связывание агонистов с ортостерическими участками рецептора приводит к серии его конформационных изменений, которые в свою очередь вызывают открытие ионного канала. Конкурентные антагонисты (включая белковые и пептидные нейротоксины) тоже взаимодействуют с участком связывания агонистов, но при этом предотвращают активацию рецептора. На холинорецепторах выявлены и другие участки взаимодействия с рядом соединений, которые вызовут ослабление или усиление ионных токов. Последние, так называемые позитивные аллостерические модуляторы (РАМ), в настоящее время представляют большой интерес как возможные лекарственные средства нового поколения. Перспективными мишенями для лекарственных препаратов могут оказаться нАХР, содержащие α7-субъединицы. Показано, что введение селективного агониста α7 нАХР оказывало нейропротекторный эффект у крыс с моделью паркинсонизма, индуцированной 6-гидроксидофамином. Новый класс соединений для лечения нейродегенеративных заболеваний могут представлять также аллостерические модуляторы, усиливающие ответы α7- и α4β2 подтипов нейрональных нАХР или частичные агонисты нАХР. К последним может быть отнесен варениклин — препарат, который сравнительно недавно стал использоваться в качестве средства, помогающего избавиться от никотиновой зависимости.

Как уже отмечалось, ранее наиболее востребованными инструментами изучения структурно-функциональных свойств нАХР служили α-нейротоксины из ядов змей, благодаря своему исключительно высокому сродству к некоторым подтипам рецептора. Однако не для всех нАХР имеются избирательно действующие на них нейротоксины змей. Так называемые «короткие» α-нейротоксины эффективно взаимодействуют только с мышечными нАХР; α-нейротоксины «длинного» типа узнают кроме мышечных также инейрональные гомоолигомерные (α7, α8, α9) холинорецепторы. Еще один токсический полипептид из яда В. multicinctus — κ-бунгаротоксин — специфичен к гетероолигомерному а3β2 нАХР. α-конотоксины, пептиды из яда морских улиток семейства Conus, являются конкурентными антагонистами нАХР и имеют высокую избирательность действия на различные подтипы холинорецепторов.

Хотя природа дала нам большое количество соединений, различающих тот или иной тип Cys-петельных рецепторов, задачи поиска и конструирования новых представителей, которые с большей избирательностью помогали бы идентифицировать, а также активировать или дезактивировать интересующий подтип определенного (например нАХР) рецептора, остаются по-прежнему актуальными. В связи с важной ролью α7 нАХР много усилий было потрачено на то, чтобы модифицировать природные α-конотоксины и получить аналоги, пригодные для идентификации этих рецепторов в тканях. Это недавно удалось американским исследователям: на основе природного α-конотоксина ArIB были получены его аналоги с несколькими заменами, несущими радиоактивные и флуоресцентные метки, вполне пригодные для надежного детектирования α7 нАХР. Нам удалось на основе α-конотоксина PnIA получить аналог, имеющий очень высокое (0,5 пМ) сродство к АХСБ L. stagnalis, а его радиоиодированное производное очень удобно для скрининга соединений с возможной холинергической активностью.

Выход на новые природные соединения, которые могли бы сыграть роль инструментов в изучении рецепторов, сегодня имеется благодаря протеомным исследованиям ядов. Так, из яда кобры Naja kaouthia нами выделен димерный α-кобратоксин, в котором две молекулы α-кобратоксина соединены двумя межмолекулярными дисульфидными связями, образовавшимися за счет межмолекулярной перегруппировки дисульфидных связей, имевшихся в исходном α-кобратоксине (рис. 2). Вывод о пространственной структуре этого нового нейротоксина и расположении дисульфидных связей был нами сделан на основании установления его кристаллической структуры. Уже давно был известен κ-бунгаротоксин, в котором две молекулы, сходные с α-бунгаротоксином, образуют прочно связанный димер, не содержащий каких-либо межмолекулярных ковалентных связей. κ-Бунгаротоксин имеет высокое сродство к гетеромерному нейрональному α3β2 нАХР, тогда как α-бунгаротоксин или α-кобратоксин блокируют только мышечный и α7 нАХР. Обнаруженный нами димерный α-кобратоксин сохранил эти исходные активности, но и приобрел способность к блокированию α3β2 нАХР.

До сих пор мы рассматривали выделенные из ядов нейроактивные белки и пептиды, мишенью для которых служат различные нАХР. Чуть более 10 лет назад американскими исследователями в мозге мыши был обнаружен ген, кодирующий белок Lynxl, предположительно имеющий ту же трехпетельную структуру, что и α-нейротоксины змей. Структура гена указывает, что эндогенный белок млекопитающих Lynxl должен иметь и существенное отличие от нейротоксинов — дополнительный гликозил-фосфатидил-инозитольный (GPI) якорь. С помощью этого якоря Lynxl прикреплен в мозге к мембране в непосредственной близости от никотиновых рецепторов и модулирует их функциональную активность. До недавнего времени Lynxl был недоступен в форме индивидуального белка. Поэтому все важнейшие исследования его функциональной активности, опубликованные в таких ведущих журналах, как Neuron и Science, были выполнены исключительно с использованием суперэкспрессии или нокаута гена Lynxl. Информации о том, каков механизм взаимодействия Lynxl с нАХР, не имелось, а прогресс в этой области наметился, когда нам в 2011 г., благодаря экспрессии в E. coli и последующей очистке, удалось получить в виде индивидуального водорастворимого белка полноразмерный Lynxl, не имеющий GPI якоря (ws-lynxl). В результате впервые были установлены концентрации, при которых можно в опытах in vitro зарегистрировать эффекты ws-lynxl на различные подтипы нАХР. При этом было впервые показано различие в характере связывания ws-lynxl с двумя основными типами нАХР: ws-lynxl конкурировал с радиоактивным α-бунгаротоксином за связывание с рецептором мышечного типа, но не конкурировал за связывание с нейрональным α7 нАХР (рис. 3а). Однако электрофизиологические опыты выявили ингибирование токов в α7 нАХР при добавлении 10 mM ws-lynxl (рис. 3б).