Мутации в гене LRRK2 и активность фермента

Начиная с момента описания первых мутаций в гене LRRK2 в 2004 г. предпринят ряд попыток оценить влияние мутаций, выявляемых у пациентов с БП, на активность фермента. В отсутствие знаний о физиологическом субстрате LRRK2 для этой цели широко использовали способность LRRK2 к аутофосфорилированию. Независимыми группами исследователей описано несколько сайтов аутофосфорилирования, большинство из которых локализовано в ROC-домене. Считается доказанным, что в физиологических условиях LRRK2 способна к гомодимеризации и проявляет функциональную активность как димер (см. рис. 1). При этом, аутофосфорилирование может происходить в процессе формирования данной структуры и регулировать активность киназы. Необходимо, однако, отметить, что способность LRRK2 к аутофосфорилированию продемонстрирована в исследованиях in vitro. Использование специфичных антител не позволило выявить фосфорилированную форму LRRK2 в клеточных лизатах. Существует вероятность того, что оно протекает только в особых условиях, в частности, в условиях стресса, на что указывает обсуждаемое взаимодействие LRRK2 с МКК-(mitogen-activated protein kinase kinases) и JIPs (JNK (c-JunN-terminal kinase)-interacting proteins) белками в условиях генерации клеточного стресса. Несмотря на то что вопрос о протекании аутофосфорилирования in vivo остается открытым, оценка активности этого процесса была широко использована в экспериментах по исследованию влияния известных мутаций гена LRRK2 на работу данной киназы. Однозначное повышение активности LRRK2 (по меньшей мере в три раза) было продемонстрировано только для мутации G2019S, расположенной в активной петле киназного домена. Данные об изменении киназной активности LRRK2 при наличии других мутаций R1441C/G/H, Y1699C, I2020T носят противоречивый характер.

He до конца ясна взаимосвязь ГТФ-азной и киназной активностей LRRK2. В нескольких работах было показано, что мутации ГТФ-азного домена (R1441C/G/H) не позволяют ему связываться с ГТФ, снижают ГТФ-азную активность белка, значительно ослабляя при этом и киназную активность. В то же время, имеются данные, свидетельствующие о том, что отсутствие связывания LRRK2 с ГТФ, ГДФ, ГМФ не влияет на ее киназную активность. Противоречивость полученных данных, вероятно, связана с использованием в эксперименте различных субстратов.

В экспериментах in vitro, преимущественно использующих различные линии нейробластомы, также широко исследовалось влияние мутаций гена LRRK2 на выживаемость и морфологию клеток. Многократно показано, что в отличие от LRRK2 дикого типа нейротоксический эффект наблюдается при экспрессии гена LRRK2 со всеми патогенными мутациями, и для проявления этого эффекта необходимо наличие киназного домена. Рядом независимых лабораторий подтверждено влияние мутаций в гене LRRK2 на рост и ветвление нейрональных отростков. Наличие мутаций приводило к укорачиванию нейритов и уменьшению их числа. Важно отметить, что индукция нейродегенерации в моделях in vivo при экспрессии мутантных форм LRRK2 также зависела от киназной активности.

Простая интерпретация вышеприведенных результатов дает основание предположить, что ингибирование киназной или ГТФ-азной активности LRRK2 будет снижать нейротоксичность, и что данный подход может быть перспективным при разработке нейропротекторных средств. В действительности все не так однозначно. Так, показано, что мутация Y1699C, расположенная в COR-домене белка, усиливает внутримолекулярное взаимодействие между доменами ROC:COR, приводя к ослаблению RОС:RОС-взаимодействия, необходимого для формирования активного димера LRRK2. В конечном итоге данная мутация приводит к более выраженной дестабилизации гомодимера LRRK2, снижению ГТФ-азной активности, чем мутации ГТФ-связывающего домена (R1441C/G/H), что в свою очередь может снижать и киназную активность фермента. Более того, было показано, что аминокислотная замена G2385R LRRK2, известный фактор риска развития спорадических форм БП, приводит к снижению киназной активности по сравнению с киназой дикого типа. До сих пор не ясно, как интерпретировать полученные результаты. По-видимому, в то время как киназная активность необходима для проявления нейротоксичности LRRK2, чрезмерное снижение активности также может приводить к повышению риска развития БП. Поэтому при разработке терапевтических средств, основанных на ингибировании активности LRRK2, нужно ожидать, что «окно» эффективности ингибиторов может оказаться достаточно узким. Необходимо отметить, что до сих пор не выяснено, способствуют ли патогенные мутации, выявляемые при БП, приобретению ферментом новых функций или потере активности (механизмы «gain-of-function» или «loss-of-function»). Описание физиологических субстратов LRRK2 поможет существенно прояснить влияние патогенных мутаций на активность фермента и ее роли в патогенезе БП.