Морфофункциональные изменения в поле СА1 гиппокампа крыс при использовании пентилентетразоловой и литий-пилокарпиновой моделей судорожных состояний

Декабрь 4, 2015 / Комментарии 0

Как было описано ранее, фармакологические модели судорожных состояний, воспроизводимых на животных, очень разнообразны и используются для выяснения механизмов, лежащих в основе эпилептогенеза и реализации судорог. Часть хемоконвульсантов, например блокатор ГАМК-ергической синаптической передачи ПТЗ, при однократном введении вызывает острый приступ судорог, что влечет за собой некоторые отставленные последствия, не сопровождающиеся возобновлением судорог. Другие хемоконвульсанты, такие как агонист мускариновых рецепторов пилокарпин, сразу после введения вызывают у экспериментальных животных эпилептический статус, а после латентного периода, длящегося несколько дней или недель, у этих животных развиваются самопроизвольные судороги. Так как долговременные поведенческие последствия при использовании пентилентетразоловой (ПТЗ) и литий-пилокарпиновой (ПК) моделей различаются, то можно ожидать наличия специфических морфологических изменений. Однако данные о существовании морфологических различий при применении ПТЗ и ПК моделей до сих пор фрагментарны.

р4

Необходимо различать обратимые изменения в нервной ткани, вызванные судорожным состоянием, и те ранние нарушения, которые ведут к долговременной эпилептизации мозга и могут быть использованы в качестве ранних биомаркеро-вэпилептогенеза. Зная специфические биомаркеры, можно использовать их в качестве индикаторов для оценки терапевтического потенциала новых противосудорожных препаратов, в особенности для предсказания их способности предотвращать эпилептогенез. Мы предположили, что при использовании ПТЗ модели морфофункциональные изменения могут иметь, в основном, транзиторный характер, тогда как изменения при ПК модели скорее должны свидетельствовать о перестройках, ведущих к эпилептизации мозга. Целью исследования стало сравнение морфофункциональных характеристик у контрольных и двух групп экспериментальных животных.

Исследование поля СА1 гиппокампа, окрашенного по методу Ниссля, у крыс контрольной группы (n=7), после ПТЗ судорог (n=12) и ПК судорог (п=8) выявило существенные морфологические различия между данными группами. В пирамидном слое гиппокампа крыс через 24 часа после судорог, вызванных ПТЗ, было обнаружено большое количество вытянутых, сморщенных гиперхромных нейронов, характеризующихся потерей тургора (29,9±3,5% от общего числа клеток, рис. 4г,д) по сравнению с контролем (3,1±1,2%, рис. 4б,в). При этом плотность расположения клеток, измеренная по числу клеток на участке пирамидного слоя поля СА1 длиной 1000 мкм, после ПТЗ судорог не изменилась (рис. 5а).

р5

После ПК судорог количество гиперхромных нейронов в гиппокампе крыс не отличалось от контроля (2,6±0,5%, рис. 5в), однако плотность расположения нейронов пирамидного слоя уменьшилась по сравнению с контролем на 21% (см. рис. 5а). В пирамидном слое обнаружены единичные нейроны в состоянии хроматолиза, характеризующиеся повышенным тургором и лизисом нисслевских глыбок в цитоплазме (рис. 4е,ж). Вокруг таких нейронов, как правило, наблюдалось большое количество глиальных клеток. Нейроны в состоянии хроматолиза практически отсутствовали у крыс контрольной группы и после ПТЗ судорог.

Оценку жизнеспособности нейронов проводили с помощью двух показателей. Во-первых, с помощью иммунофлуоресцентного метода оценивалась экспрессия белка NeuN (Fox3) в нейронах гиппокампа, так как ранее было показано, что этот белок экспрессируется только в нормально функционирующих нейронах. Во-вторых, исследовали активность проапоптотической каспазы-3 в ткани гиппокампа. Было выявлено, что после ПТЗ судорог экспрессия белка NeuN в пирамидном слое поля СА1 гиппокампа наблюдалась во всех нейронах, включая гиперхромные клетки. Общее число NeuN-позитивных нейронов у таких животных не отличалось от такового в контроле (рис. 5б). После ПК судорог наблюдалось снижение числа NeuN-позитивных нейронов в пирамидном слое примерно на 15% (см. рис. 5б). Активность каспазы-3 в ткани гиппокампа не изменялась после ПТЗ судорог, однако возрастала на 60% после ПК (см. рис. 5г).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при ПТЗ модели не происходит гибели нейронов поля СА1 гиппокампа в первые сутки, тогда как при ПК модели убыль нейронов весьма существенна, и этот процесс, по-видимому, продолжается, так как активность каспазы-3 в ткани повышена. Важно отметить, что гиперхроматоз нейронов не является признаком их гибели, так как эти нейроны продолжают экспрессировать белок NeuN.

Судороги могут вызывать повышение внеклеточной концентрации глутамата, а избыточный глутамат в нервной ткани, в свою очередь, индуцирует увеличение содержания переносчика возбуждающих аминокислот ЕААТ1, поэтому было изучено, как изменяется содержание ЕААТ1 в ткани гиппокампа при ПТЗ и ПК моделях. В обеих моделях было обнаружено повышение содержания ЕААТ1 по сравнению с контролем примерно на 40% (рис. 5д).

В настоящей работе впервые выполнено сравнительное исследование комплекса морфофункциональных изменений в гиппокампе крыс при ПТЗ и ПК моделях судорожных состояний с использованием единой методологии проведения экспериментов и обработки данных. Это позволяет считать, что найденные различия между экспериментальными группами обусловлены специфическими особенностями молекулярно-клеточных механизмов реализации судорожных состояний в этих моделях. Для сравнительного исследования нами была выбрана область СА1 гиппокампа, так как ранее в этой области были показаны существенные морфологические нарушения при ПК модели у крыс. В этом отделе мозга наблюдается как гибель пирамидных клеток, так и отдельных типов интернейронов, интенсивный нейрогенез, изменения типов ветвления дендритных отростков нейронов, нарушения формирования нейронных сетей. По-видимому, все это ведет к появлению эпилептических очагов. Также следует отметить, что гиппокамп является одним из ключевых отделов мозга, участвующих в реализации судорожных состояний как при ПТЗ, так и при ПК моделях.

Проведенный анализ морфофункциональных изменений в зоне СА1 гиппокампа при судорожных состояниях показал, что изменения делятся на специфичные либо для ПК, либо для ПТЗ модели и на те, которые наблюдаются при обеих моделях. Так, мы обнаружили, что в гиппокампе крыс при использовании ПК модели, в отличие от ПТЗ модели и контрольной группы, наблюдаются явные признаки нейродегенерации. Во-первых, уже через 24 часа происходит уменьшение плотности расположения нейронов примерно на 20%, во-вторых, среди оставшихся нейронов около 15% не экспрессируют белок NeuN, а снижение уровня экспрессии этого белка является надежным показателем гибели дифференцированных нейронов. В-третьих, в ткани гиппокампа крыс при использовании ПК модели наблюдается повышение почти на 60% активности каспазы-3, которая является важным инициатором и регулятором клеточного апоптоза. Таким образом, полученные данные показывают, что ранние нейродегенеративные изменения в зоне СА1 гиппокампа могут являться важной предпосылкой эпилептизации мозга.

Специфичным для ПТЗ модели было появление большого количества гиперхромных нейронов, тогда как такие нейроны практически полностью отсутствовали в гиппокампе крыс контрольной группы и при использовании ПК-модели. Появление гиперхромных нейронов было показано ранее при изучении электросудорожной и бикукуллиновой моделей эпилепсии, a также при ПТЗ модели, хотя в некоторых случаях однократное введение судорожных доз ПТЗ не вызывало появления гиперхромных нейронов. Гиперхромные нейроны были найдены некоторыми авторами в гиппокампе и при использовании ПК модели. В настоящее время гиперхромные нейроны со сниженным тургором обычно рассматриваются не как гибнущие клетки, а как нейроны с временными нарушениями жизнедеятельности, поскольку с большой степенью вероятности они могут восстановить свою функцию. Наши экспериментальные данные согласуются с этими представлениями, так как мы показали способность гиперхромных нейронов экспрессировать белок NeuN, что свидетельствует об их нормальной жизнеспособности. Можно считать, что появление гиперхромных нейронов не является необходимым и достаточным признаком начинающейся эпилептизации мозга.

Природа гиперхромных нейронов до сих пор не ясна, однако предполагается, что их происхождение может быть связано с длительной деполяризацией мембраны, вызванной в том числе избыточной активацией глутаматных рецепторов. В наших экспериментах при использовании обеих моделей можно было ожидать повышения содержания глутамата в нервной ткани, вызванного судорожной активностью. Литературные данные свидетельствуют о том, что концентрация глутамата действительно повышается в данной области во время судорожной активности, при этом концентрация глутамата, как правило, выше при судорогах, вызванных блокадой ГАМКергической передачи, то есть при растормаживании. Показано, что ПТЗ является антагонистом ГАМКа рецепторов (1С50=0,6 мМоль/л), поэтому, вероятно, различия в концентрации глутамата и динамике ее изменений при использовании ПК и ПТЗ моделей являются определяющими для появления гиперхромных нейронов.

О повышении концентрации глутамата в ткани гиппокампа при использовании обеих моделей косвенно свидетельствуют наши данные об увеличении экспрессии переносчика возбуждающих аминокислот ЕААТ1. Его содержание в глиальных клетках обычно компенсаторно возрастает в ответ на избыток глутамата во внеклеточной среде.

Проведенное морфофункциональное сравнительное исследование поля СА1 гиппокампа крыс при использовании ПК и ПТЗ моделей таких состояний позволило выявить корреляты обратимых изменений в нервной ткани, вызванных судорожным состоянием, таких как появление гиперхромных нейронов и повышенное содержание переносчика возбуждающих аминокислот ЕААТ1. Также выявлены признаки нейродегенерации при ПК модели: уменьшение плотности расположения клеток, снижение экспрессии белка NeuN, увеличение активности каспазы-3, вероятно, ведущие к долговременной эпилептизации мозга. Эти признаки можно использовать в качестве индикаторов (биомаркеров) для оценки терапевтического потенциала новых противосудорожных препаратов.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также