Молекулярные маркеры в клетках крови при БП

Декабрь 1, 2015 / Комментарии 0

Эта работа выполнена в Институте биологии гена РАН Н.Е. Воробьевой, Н.В. Сошниковой, А.Н. Красновым под руководством С.Г. Георгиевой. Молекулярные процессы, протекающие в пораженных участках головного мозга при патогенезе БП, хорошо известны. Они включают в себя как изменение количества ферментов биосинтеза дофамина, так и рецепторов к дофамину. Причиной данных нарушений зачастую является изменение уровня экспрессии генов, кодирующих данные белки. Измерение уровня транскрипции данных генов могло бы являться надежным маркером раннего патогенеза. Однако материалом для подобных измерений должны являться соответствующие участки головного мозга, извлечение которых не представляется возможным. Поэтому поиск молекулярных маркеров БП должен проводиться на материале периферических тканей (таких как кровь).

Первоначально были сделаны попытки использовать в качестве таких периферических маркеров гены, кодирующие рецепторы к дофамину. Было продемонстрировано достоверное снижение уровня транскрипции данных генов в лимфоцитах больных БП. Нами было показано снижение уровня транскрипции генов рецептора DRD3 к дофамину в крови пациентов на ранних клинических стадиях болезни Паркинсона (табл. 10). Несмотря на относительный успех первичных исследований, использование данного маркера для широкомасштабной диагностики пациентов не представляется возможным. Экспрессия генов, кодирующих рецепторы к дофамину, в периферических тканях происходит на чрезвычайно низком уровне, который ограничивается несколькими копиями кодирующих РНК на клетку. Измерения таких незначительных молекулярных изменений характеризуются высокой технической сложностью. Такие измерения могут быть с высокой достоверностью произведены в лабораторных условиях высококвалифицированным персоналом с использованием приборов для амплификации ДНК в реальном времени. Использование подобной методики измерения в клинической практике не представляется оправданным из-за технической сложности, определяющей практическую невозможность валидации метода.

т10

Обнаруженные проблемы с детекцией транскрипции нейрональных генов в клетках крови привели к изменению стратегии поиска ранних маркеров БП. Было решено использовать подходы массового скрининга изменений уровня транскрипции генов, экспрессирующихся в клетках крови, для выявления непрямых, но легко детектируемых маркеров, коррелирующих с данным заболеванием. Измерение уровня экспрессии проводилось по технологии микрочипов на достаточно больших выборках доноров.

Подобные широкомасштабные эксперименты привели к созданию достаточно надежного набора молекулярных маркеров, позволяющих диагностировать у пациента болезнь Паркинсона на ранней клинической стадии. Данный набор включал в себя анализ уровня транскрипции восьми генов. Каждый из этих генов сам по себе, однако, не представлял значимой ценности в качестве маркера, так как изменения уровня их транскрипции были незначительными (не более чем в 2 раза) и не позволяющими проанализировать их достоверно. Более серьезных успехов добилась другая группа исследователей, проводившая подобный массовый скрининг транскрипции генов, которая включила в исследование также измерения уровня различных сплайс-вариантов транскриптов генов. Нарушение сплайсинга транскриптов нейрональных генов у пациентов с болезнью Паркинсона было обнаружено различными группами исследователей. Для нейронального гена АТР13А2 было продемонстрировано нарушение включения 13-го экзона в состав его транскрипта. Причем аберрантная форма транскрипта детектировалась в клетках периферической крови. Нарушение альтернативного сплайсинга при болезни Паркинсона было также показано для фактора synophilin-1, являющегося важным участником патогенеза нейродегенеративных заболеваний. Кроме изменения соотношения альтернативных транскриптов нейрональных генов были также обнаружены факты нарушения функционирования самого аппарата сплайсинга у пациентов с болезнью Паркинсона. Было показано, что белок DJ-1, играющий важную роль в развитии редких генетических форм болезни Паркинсона, способен ингибировать сумоилирование фактора сплайсинга РТВ, влияя тем самым на его функциональную активность. Патогенез болезни Паркинсона включает в себя значительное повреждение мембран митохондрий нейронов, которое также приводит к нарушению механизмов сплайсинга. Таким образом, нарушение функционирования аппарата сплайсинга можно считать частью патогенеза болезни Паркинсона. Этот факт может быть использован при поиске маркеров данного заболевания. Измерение изменения соотношения альтернативных транскриптов генов в периферических тканях может стать удобной методикой диагностики заболевания. Для создания подобной методики может быть использована следующая стратегия. Изменение соотношения альтернативных транскриптов генов-маркеров болезни Паркинсона в клетках крови должно быть подтверждено на достоверной выборке пациентов. Далее наличие таких же изменений должно быть подтверждено на лабораторной модели БП (например, мышах, с введением МРТР). После этого данные маркеры могут быть протестированы на лабораторной модели ранних, доклинических стадий данного заболевания. Этот подход даст возможность отобрать из предполагаемых маркеров те, которые будут иметь теоретически большую прогностическую ценность для диагностики заболевания на доклинических стадиях.

Для первичного анализа генов, обладающих альтернативным сплайсингом транскритов, нами были отобраны несколько генов из скринингов, проведенных ранее, а также ген PHF10, участвующий в пролиферации нервных стволовых клеток. Нейродегенеративные изменения мозга часто бывают связаны с нарушением экспрессии генов, играющих важную роль в процессе дифференцировки нервных клеток из предшественников. Специализированные нейроны и глиальные клетки дифференцируются из мультипотентных клеток-предшественников нейронального эпителия. Решение о том, уйдет ли клетка в дифференцировку или будет оставаться потентной, регулируется внутренними и внешними механизмами — сигналами окружающей среды, взаимодействиями с соседними клетками или транскрипционными процессами, опосредованными bHLH, STAT/Smad белками и ядерными рецепторами. Быстрая реорганизация ядра и глобальные изменения в экспрессии генов в только что образовавшемся нейроне свидетельствуют о происходящей в нем реструктуризации хроматина и значительных изменениях на эпигенетическом уровне.

Реструктуризация хроматина — это совокупность процессов, включающих смещение нуклеосомы вдоль ДНК, перенос нуклеосомы на другую нить ДНК, замена гистонов в составе нуклеосомы на их варианты и прочие процессы. В ядре эти процессы осуществляются с помощью больших белковых комплексов за счет энергии гидролиза АТФ. В составе каждого комплекса есть соответствующий фермент — АТФаза. Огромное количество исследований в настоящее время сосредоточено на изучении ремоделирующих комплексов семейства hSWI/SNF, коровой АТФазой которого могут быть два высокогомологичных между собой фермента — Brm и Brg1. Brg1 является ключевой субъединицей на разных стадиях развития нервной системы. Мышиные эмбрионы, полностью лишенные Brgl, погибают еще на стадии до имплантации. А гетерозиготные мутанты погибают на стадии имплантации, имея дефекты нервной трубки. Мутации в другой коровой субъединице BAF155 также приводят к нарушениям в нервной трубке и являются летальными. Субъединицы хроматин-ремоделирующих комплексов играют очень важную роль при формировании синапсов в процессе развития и во взрослом состоянии. Генетические исследования больных шизофренией и людей с синдромом Дауна выявили SNP (single-nucleotide polymorphism) в кодирующих участках генов субъединиц ремоделирующих комплексов — SMARCA2, BRM. Изменения в экспрессии гена киназы DYRK1A приводят к нарушению правильной работы NRSF/REST-SWI/SNF комплекса и дефициту в дендритогенезе и синаптогенезе у взрослых.

Среди SWI/SNF комплексов, ремоделирующих хроматин, можно выделить два подсемейства — BAF и PBAF. Комплексы имеют общую коровую часть, включающую АТФазу, и отличаются специфическими субъединицами, отвечающими за привлечение ремоделирующего комплекса на хроматин. Комплексы семейства SWI/SNF очень гетерогенны по своему составу. Хорошо описаны четыре возможных варианта субъединицы BAF45 — А, В, С, D. Только одна из этих четырех субъединиц способна находиться в составе ремоделирующего комплекса. Каждая из субъединиц экспрессируется в определенных типах нервных клеток на определенных стадиях развития нервной системы. Варианты имеют также и другие субъединицы — BAF155 и BAF170 — обе являются коровыми, выполняющими структурную функцию. Подобный комбинаторный принцип сборки хроматин-ремоделирующих комплексов позволяет реализовать большое количество их функциональных вариантов, каждый из которых обладает своей специфичностью. Разнообразие субъединиц комплекса позволяет создавать уникальное белковое окружение партнеров, транскрипционных кофакторов и различных активаторов, необходимых для аттенюирования работы ремоделирующего комплекса.

При нарушениях в экспрессии какого-либо гена может меняться субъединичный состав комплекса и как следствие — меняться круг его партнеров, приводя к нарушениям транскрипционных программ, необходимых для поддержания базальных и активируемых нейрональных функций.

Недавно нами были обнаружены новые кодирующие транскрипционные варианты и как следствие — новые изоформы белка BAF45a/PHF10. Описанная ранее изоформа PHF10-P имеет в своем составе консервативный SAY домен и два PHD домена. Новый, описанный нами альтернативный транскрипт PHF10 обладает другой экзонинтронной структурой на 3’-конце. Охарактеризованная нами форма белка PHF10-S не содержит PHD домены на С-конце, но несет в себе зависимый от фосфорилирования сайт конъюгации с посттрансляционной модификацией SUMO-1. Существование подобной формы позволяет предположить, что ее включение в PBAF комплекс может приводить к существенному изменению его функций и механизма действия. Мы подтвердили это предположение — действительно, PBAF комплекс, имеющий в своем составе PHF10-P, характерен для пролиферирующих клеток и необходим для поддержания их пролиферативного статуса. А форма PHF10-S контролирует гены апоптоза и не оказывает влияние на пролиферацию.

Если экспрессия транскрипционных сплайс-вариантов и белковых изоформ PHF10 будет связана с нарушением функционирования нервных клеток и нейродегенеративными заболеваниями, то данный ген можно будет использовать в качестве маркера для диагностики подобных заболеваний.

Для проверки возможности использования гена PHF10, а также гена рkm2 в качестве прогностических маркеров развития БП было решено вначале подтвердить наличие изменений в экспрессии данных генов на поздней, клинической стадии заболевания. Анализ экспрессии данных генов проводился на материале периферической ткани (крови) пациентов, а также здоровых людей. В процессе исследования из форменных элементов крови была выделена РНК при помощи TRI реагента (Molecular Research Center, Inc.). На полученном материале была проведена реакция обратной транскрипции реактивами Maxima RT (Thermo Scientific). Синтезированная оцДНК была использована для дальнейшего анализа при помощи амплификации в реальном времени. В качестве референса для каждого образца был проанализирован уровень экспрессии контрольного гена еnу2. Количество транскриптов экспериментальных генов (PHF10 и рkm2) было оценено относительно количества транскриптов контрольной РНК. Для амплификации специфического сплайс-варианта гена рkm2, ассоциированного с БП, были использованы праймеры, указанные в первоначальном скрининге. Для амплификации PHF10-P и PHF10-S сплайс-вариантов гена PHF10, были созданы новые уникальные праймеры. Оказалось, что уровень сплайс-варианта гена ркт2 действительно изменяется у пациентов с БП в соответствии с ожидаемым (табл. 11). Уровень транскрипта данного гена значимо снизился в выборке больных по сравнению с выборкой здоровых людей. Однако амплитуда наблюдаемых нами изменений была несколько ниже той, которую обнаружили исследователи в первоначальном скрининге. Мы предполагаем, что наблюдаемая нами разница может быть связана с размером используемой нами выборки и планируем продолжить данный анализ и повысить достоверность полученного результата. Кроме гена ркт2 нами была также проанализирована экспрессия специфических сплайс-вариантов гена РНЕ10. Оказалось, что уровень транскрипта РОТ10-Р снижается более чем в 2 раза у пациентов с БП по сравнению с контрольной выборкой. При этом уровень транскрипта РHF10-8 изменяется не значимо. Данный результат согласуется с ожиданиями, так как именно РHF10-Р-форма белка, кодируемая транскрип-том РНF10-Р, необходима для поддержания пролиферирующего статуса клеток, в отличие от РHF10-S-формы.

т11

Снижение уровня экспрессии генов, характерных для пролиферирующих клеток, согласуется с данными о значительном нарушении пролиферации клеток, ассоциированном с нейродегенеративными заболеваниями, такими как БП.

В результате проделанной работы мы подтвердили возможность использования сплайс-варианта гена рkm2, а также сплайс-вариантов РHF10-Р и РHF10-S гена РНF10 для диагностики БП на клинических стадиях. Далее мы планируем провести анализ данных маркеров на лабораторной модели данного заболевания. Если исследуемые маркеры продемонстрируют значимые изменения на лабораторной модели, то мы планируем провести их измерение на ранних, доклинических стадиях. Данный подход позволит нам проверить возможность использования специфических сплайс-вариантов генов рkm2 и РНF10 в качестве прогностических маркеров развития БП на ранних, доклинических стадиях.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также