Молекулярно-генетическое изучение болезни Паркинсона в Республике Башкортостан

Декабрь 4, 2015 / Комментарии 0

Болезнь Паркинсона (БП) — прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, частота которого среди лиц старше 55 лет составляет ~2%. В популяциях мира распространенность БП составляет 60-187 на 100 000 населения, в Республике Башкортостан — 68,6 на 100 000; частота семейных форм БП — 5,95%, что в значительной степени соответствует среднемировым показателям.

В основе БП лежат дегенеративные изменения, в основном в дофаминергических нейронах черной субстанции ствола головного мозга, и снижение поступления в них двигательного нейромедиатора дофамина. Дефицит дофамина в стриатуме приводит к нарушению функционирования подкорково-корковых систем мозга, регулирующих двигательные функции, и проявляется в виде сочетания гипокинезии с ригидностью и/или тремором покоя и, в более поздней стадии, — с постуральной неустойчивостью. Главным патогенетическим механизмом гибели дофаминергических нейронов считается повышенный уровень апоптоза, обусловленный развитием в клетках окислительного стресса. Ключевую роль в развитии окислительного стресса, ведущего к нейродегенерации, играют митохондриальная дисфункция (блокада митохондриального комплекса I) и нарушение внутриклеточной убиквитин-зависимой деградации поврежденных белков, приводящие к накоплению в клетках свободных радикалов, источниками которых могут являться различные эндогенные и экзогенные нейротоксины.

т1

В большинстве случаев БП носит спорадический характер и имеет многофакторную природу с определенной генетической предрасположенностью, но существуют и моногенные формы заболевания. В настоящее время картировано 13 генных локусов, связанных с отдельными наследственными формами БП, отличающимися по типу наследования, возрасту манифестации и характеру прогрессирования заболевания; в одиннадцати из них идентифицированы гены (табл. 1). Для выяснения роли генетических факторов в развитии спорадической БП активно исследуются как гены-кандидаты, продукты которых могут быть задействованы в различных звеньях патогенеза заболевания, так и гены, выявленные на основе полногеномного анализа ассоциаций БП (GWAS) с сотнями тысяч маркеров — однонуклеотидных полиморфных вариантов ДНК (SNP). В настоящее время в электронной базе данных по генетике БП представлены результаты 880 исследований, включающих анализ 915 генов и 3446 их полиморфных локусов, а также 889 метаанализов, подтвердивших ассоциацию 20 генных локусов со спорадической формой БП. В результате GWAS были выявлены хромосомные области, содержащие определенные варианты SNP, с высоким уровнем статистической значимости, ассоциированные с болезнью Паркинсона. По данным метаанализа результатов GWAS, проведенного Международным консорциумом по геномным исследованиям БП, с данным заболеванием ассоциированы полиморфные варианты 11 генов (SNCA, МАРТ, BST1, HLA-DRB5, LRRK, CCD62(HIP1R), CYT11, GAK, МССС1 (LAMP3), STK39, ACMSD). Уровень значимости ассоциации выявленных аллелей этих генов составляет 10в-9—10в-47, но относительный риск для любого из этих локусов не превышает 1,3. Кроме того, было установлено, что генетические варианты оказывают различный эффект на развитие БП в европейских и азиатских популяциях. В разных этнических группах ассоциации полиморфных локусов генов с БП различны. Популяционные различия могут быть связаны с различной частотой аллелей в популяциях и с неравновесным сцеплением (неслучайной ассоциацией аллелей расположенных рядом локусов). Некоторые гены могут быть ассоциированы с БП как в европейских, так и в азиатских популяциях, но полиморфные маркеры (SNPs) этих генов для разных популяций могут быть различны. В связи с этим в настоящее время актуальным является репликативный анализ данных GWAS в различных популяциях мира, характеризующихся своеобразием генофонда и не вошедших в полногеномные исследования.

Молекулярно-генетическое исследование спорадической болезни Паркинсона в Республике Башкортостан, проводимое в течение последних десяти лет, включало: 1) поиск у всех обследуемых больных мутаций в генах, связанных с моногенными формами БП — α-синуклеина (PARK1), паркина (PARK2) и дардарина (LRRK2); 2) анализ мтДНК у пациентов с БП и в контрольных группах, включающий определение гаплогрупп мтДНК, поиск мутаций в гене цитохрома b; а также полное секвенирование мтДНК у 4 больных с определенными гаплогруппами мтДНК; 3) анализ ассоциации спорадической БП с полиморфными вариантами ряда генов-кандидатов (Yb8NBC36 Alu-инсерционного локуса гена клиевого канала KCNJ6; делеционного полиморфизма генов глутатионтрансфераз GSTMI(0/0) и GSTT1(0/0); рестрикционных полиморфных вариантов p.Ile462Val гена цитохрома семейства р-450 CYP1A1, p.Glnl91Arg гена параоксоназы 1 (PON1)); исследование роли генов нейромедиаторной системы в развитии спорадической БП и нейропсихологических нарушений у пациентов с данным заболеванием, проведенное на основе анализа полиморфизма генов тирозингидроксилазы (ТН), дофаминового транспортера (DAT1), катехол-О-метилтрансферазы (СОМТ), моноаминоксидазы В (МАО-В), триптофангидроксилазы (ТРН1), рецепторов дофамина Д1-Д4 (DRD1, DRD2, DRD3, DRD4), серотонинового транспортера (5-НТТ), рецепторов серотонина 1В(HTR1B), 2А(HTR2A) и 2С(HTR2C): 4) репликацию данных полногеномных анализов ассоциации с БП в Республике Башкортостан.

В работе использован банк ДНК пациентов с идиопатической болезнью Паркинсона (581 чел. — 98 башкир, 219 русских и 264 татар), средний возраст манифестации болезни которых составил 58,6±0,39 лет. Клинический осмотр больных проводился сотрудниками кафедры неврологии Башкирского государственного медицинского университета. Выборка группы здоровых доноров (578 чел. — 125 башкир, 139 русских и 314 татар) соответствовала группе больных по возрасту, этнической принадлежности и территории проживания.

Основные, наиболее значимые, на наш взгляд, результаты этих исследований мы представляем в настоящей главе.

Так, было установлено, что мутации в генах, ответственных за моногенные формы БП, вносят небольшой вклад в развитие спорадической БП: в гене PARK2 выявлена новая мутация — делеция 12-го экзона в гетерозиготном состоянии с частотой 5,26%. 12-й экзон кодирует С-концевой участок паркина, в котором расположен RING домен, отвечающий как за связывание с белками-мишенями паркина, так и с Е2-убиквитином. Возможно, что обусловленное делецией нарушение структуры гена паркина, по крайней мере частично, блокирует биологическую функцию его белкового продукта. Учитывая это, можно предположить, что делеция экзона 12 гена PARK2 в гомозиготном состоянии может вести к развитию ювенильной болезни Паркинсона по аналогии с делециями других экзонов этого гена. В гетерозиготном состоянии эту делецию можно рассматривать как фактор предрасположенности к развитию спорадической БП или даже как причину развития этой формы паркинсонизма. О такой возможности указывают имеющиеся сведения о том, что даже гетерозиготность по мутациям в гене паркина ведет к нарушению обмена дофамина в стриатуме у родственников больных с аутосомно-рецессивным ювенильным паркинсонизмом. В гене LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) в результате скрининга трех известных, наиболее частых, мутаций у 341 пациента со спорадической БП и у 360 человек из группы контроля были выявлены две миссенс-мутации — p.Gly2019Ser и p.Gly2385Arg; мутация p.Ile2020Thr в наших выборках пациентов с БП и контроля не обнаружена. Мутация p.Gly2019Ser была идентифицирована у одной больной башкирской этнической принадлежности, имеющей акинетико-ригидно-дрожательную форму БП с манифестацией заболевания в 63 года. Ее частота в этнической группе башкир составила 1,79%. Примерно с такой же частотой данная мутация выявлена в популяциях Европы. Замена p.Gly2385Arg обнаружена у двух больных татарской этнической принадлежности с частотой 1,28% среди татар. Одна из этих больных имела ригидно-дрожательную форму заболевания с манифестацией в 62 года, один больной — акинетико-ригидно-дрожательную форму БП с манифестацией в 36 лет. Полиморфизм p.Gly2385Arg ранее был описан, он выявлен как среди больных, так и среди контроля в Тайване и Сингапуре. В исследуемой нами группе контроля описанные две мутации (полиморфные варианты) не обнаружены.

Исследование роли митохондриальной ДНК в развитии болезни Паркинсона было проведено только в группах больных (N= 157) и контроля (N=183) татарской этнической принадлежности. В результате исследования полиморфизма мтДНК, основанного на секвенировании гипервариабельного сегмента I и рестрикционном анализе 11 однонуклеотидных полиморфных локусов кодирующего региона, были выявлены достоверные различия, характеризующиеся значительным преобладанием среди больных гаплогруппы Н (39,5% больных) и у 20,0% контроля (OR=2,58, CI=1,55-4,30, р=0,0008) и уменьшением частоты гаплогруппы U (16,6% и 34,4%, соответственно) (OR=0,38, CI=0,22-0,66, р=0,0002). Протективные свойства гаплогрупп U, К, J, Т для развития БП были показаны ранее и другими авторами. Ассоциация гаплогруппы Н с БП, выявленная нами только в популяции татар, ранее не описана. В результате секвенирования гена митохондриального цитохрома В в выборках больных (n=58) и контроля (80) татарской этнической принадлежности было выявлено 16 миссенс-мутаций и 9 синонимичных нуклеотидных замен. Достоверно значимое различие было показано для мутации Т15693С, обнаруженной только в контроле и не выявленной у больных, а также установлен гаплотип 15693С-15218А-14793А, ассоциированный с гаплогруппой U, который можно считать протективным для БП в популяции татар (OR=0,04, CI=0,006-0,65, р=0,002). С целью более углубленного исследования природы выявленных ассоциаций гаплогрупп мтДНК с БП мы провели полное секвенирование мтДНК (16569 пн) у 4 пациентов татарской этнической принадлежности, двое из которых имели гаплогруппу Н, двое — кластер гаплогрупп UK; полученные результаты секвенирования сравнивались с Кембриджской последовательностью мтДНК (rCRS). Наиболее интересным результатом, на наш взгляд, оказалась выявленная у носителя субгаплогруппы Н2 в гомоплазмическом состоянии миссенс-мутация 4659G>A (p.Ala64Thr) в высококонсервативном сайте гена ND2. У пациента с гаплогруппой Ukl была выявлена миссенс-мутация 7637G>A/G (p.Glul8Lys) в гене СОII в гетероплазмическом состоянии. Обе эти мутации, предположительно, имеют функциональную значимость и могут обусловливать предрасположенность к БП у данных пациентов.

В результате исследования в группах больных и контроля полиморфизма указанных выше ядерных генов-кандидатов БП было установлено, что генетическим фактором риска развития заболевания для всех исследованных этнических групп населения Башкортостана является Alu-инсерция Yb8NBC36 гена калиевого канала KCNJ6 (генотип *I/*I и аллель *I).

При исследовании роли полиморфизма генов системы метаболизма моноаминов в развитии БП и нейропсихологических нарушений у пациентов с БП ассоциации с заболеванием установлены в этнических группах татар и башкир: для татар маркерами риска развития БП можно считать генотип *Н/*Н (р=0,0006; OR=2,3) и аллель *Н полиморфного локуса p.Vall08Met гена СОМТ, генотип *С*С (р=0,002; OR=1,7) и аллель *С (р=0,02; OR=1,34) локуса rs 1800532 гена ТРН1; аллель *12 полиморфного локуса STin2 (р=0,04; OR=1,3) гена 5-HTT: для башкир — аллель *С локуса rs6280 гена DRD3 (р=0,02; OR=1,85). При исследовании нейропсихологических нарушений установлено только влияние полиморфизма локуса p.Vall08Met гена СОМТ на развитие деменции у больных БП.

Репликация данных полногеномного анализа ассоциаций с БП в этнических группах русских, башкир и татар из Республики Башкортостан включала исследование 4 полиморфных локусов гена α-синуклеина (SNCA, 4р22) — rs356219, rs356165, rs2737020, rs653219, и 6 полиморфных локусов хромосомного региона 17q21.31, содержащего ген белка тау, ассоциированного с микротрубочками аксонов (МАРТ) — rs11012, rs2942168, rs393152, rsl724425, rsl981997 и rsl2373139. Выбранные для исследования хромосомные регионы и полиморфные локусы, согласно данным GWAS, имели наибольшие показатели степени ассоциации с БП. Кроме того, α-синуклеин и τ — это два распространенных белка мозга, агрегаты которых обнаруживаются при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и прогрессирующий супрануклеарный паралич. Кодируемый геном SNCA α-синуклеин — основной белковый компонент телец Леви, обнаруживаемых у большинства пациентов с БП в сохранных дофаминергических нейронах. Предполагают, что α-синуклеин связывается с мембраной везикул в нервных клетках и участвует в процессах контроля транспорта везикул к пресинаптической мембране, являясь негативным регулятором дофаминергической нейротрансмиссии. Кодируемый геном МАРТ белок тау, ассоциированный с микротрубочками аксонов, регулирует динамику микротрубочек, располагая их параллельными пучками. Известен целый ряд различных мутаций этого гена, приводящих к развитию моногенного нейродегенеративного заболевания — фронтотемпоральной деменции с паркинсонизмом. Ассоциация спорадической болезни Паркинсона с геном МАРТ также была описана ранее, и в некоторых исследованиях было установлено, что большой гаплотипический блок, содержащий ген МАРТ, ассоциирован с риском развития БП. В то же время, установленные ассоциации БП с геном МАРТ до сих пор являются недостаточно понятными, поскольку при идиопатической БП конкретная патология самого белка тау не установлена и, кроме того, полиморфные локусы гена МАРТ не были идентифицированы как маркеры риска развития болезни Альцгеймера в GWAS исследовании, где была полностью исключена патология, приводящая к фронтотемпоральной деменции. Возможно, что отдельные мутации гена МАРТ и сцепленные с ними полиморфные маркеры могут быть ассоциированы с отдельными клиническими признаками БП.

После опубликования данных полногеномных анализов ассоциации с БП был проведен ряд репликативных исследований, включающих анализ полиморфных локусов генов SNCA и МАРТ-региона, выявивший, как и ожидалось, достаточно противоречивые результаты.

В ходе проведенного нами репликативного исследования были определены частоты генотипов и аллелей указанных выше десяти полиморфных локусов генов SNCA и МАРТ-региона в группах больных БП и здоровых лиц, представителей трех этнических групп населения РБ. Во всех обследованных выборках по всем исследованным SNP-локусам распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга (р>0,05); для некоторых полиморфных локусов установлен неоднородный характер распределения частот генотипов и аллелей в трех этнических группах. Интересными оказались результаты анализа ассоциации исследованных полиморфных локусов с болезнью Паркинсона, по-разному проявившейся в трех обследованных нами этнических группах. Так, по трем из четырех локусов гена SNCA (rs356219, rs356165 и rs2737020) ассоциация полиморфных вариантов с БП выявлена только в популяции русских и не подтверждена в популяциях татар и башкир; по одному локусу этого гена (rs653219) статистически значимые различия по частоте генотипов и аллелей между больными и контрольной группой установлены только в этнической группе татар. В то же время, по пяти из шести локусов МАРТ-региона (rs2942168, rs393152, rsl724425, rs1981997 и rs 12373139) ассоциации полиморфных вариантов с БП выявлены только в этнической группе татар и лишь по локусу rs11012 — только в этнической группе русских. В этнической группе башкир ни по одному из полиморфных локусов, представленных в данном исследовании, ассоциация с БП не установлена. В итоге, по данным GWAS — репликативного исследования, для жителей Республики Башкортостан маркерами риска развития БП можно считать следующие полиморфные варианты: для этнической группы русских — аллель *G локуса rs356219 (р=0,006; OR=1,58), аллель *G локуса rs356165 (р=0,003; OR=1,64), генотип *Т/С локуса rs2737020 (р=0,02; OR=1,6) гена SNCA; аллель *А (р=0,007; OR=2,12) и генотип *G/A(p=0,02; OR=2,09) локуса rsl 1012 МАРТ-региона; для этнической группы татар — аллель *Т (р=0,04; OR=1,40) и генотип *С/Т (р=0,002; OR=1,73) гена SNCA; аллель *С (р=0,02; OR=1,60) и генотип *С/С (р=0,01; OR=1,75) локуса rs2942168, аллель *А (р=0,001; OR=1,92) и генотип *А/А (р=0,001; OR=2,06) локуса rs393152, аллель *С (р=0,04; OR=1,3) и генотип *С/С (р=0,01; OR=1,57) локуca rs1724425, аллель *С (р=0,01; OR=1,72) и генотип *С/С (р=0,009; OR=1,84) локуса rs 1981997 и генотип *С/С (р=0,02; OR=1,70) локуса rsl2373139 МАРТ- региона.

Как уже было сказано, согласно результатам GWAS, проанализированные нами полиморфные ДНК-локусы показали наибольшие значения степени ассоциации с БП, но по данным ряда репликативных исследований, проведенных в отдельных популяциях мира, были получены противоречивые результаты. Среди этих данных большой интерес привлекают результаты анализа полиморфизма локусов rs356219 и rs356165, локализованных в 3′-области гена SNCA, и локуса rs2737020 в 4-м нитроне гена, сцепленного с микросателлитным локусом Rep1(D4S3481), локализованным на 10 kb выше сайта трансляции гена, влияющим на транскрипционную активность и экспрессию гена SNCA, для которого также установлена ассоциация с БП в отдельных европейских популяциях (с аллелем 263 п.н.). Ассоциация полиморфных вариантов локуса rs356165 с БП показана для популяций Японии, Германии, Ирландии и Норвегии, а также установлена в результате метаанализа, но, в то же время, она не подтверждена для бельгийской популяции и популяции Китая. В ирландской популяции наряду с локусами rs356219 и rs356165, достоверно значимая ассоциация с БП была выявлена и для локуса rs2737020, но при этом установлены протективные в отношении развития заболевания полиморфные варианты гена. Для полиморфного локуса rs6532194 гена SNCA, согласно данным метаанализа, ассоциация с БП установлена в популяциях Азии. Полученные нами результаты, подтверждающие ассоциации определенных полиморфных вариантов гена SNCA в этнических группах русских и татар, в целом, соответствуют аналогичным данным, полученным для большинства европейских популяций.

Для полиморфных локусов хромосомного региона 17q21.31, содержащего ген МАРТ, большинство установленных на сегодняшний день ассоциаций с БП относится, в основном, к европейским популяциям. Так, уже в ходе отдельных полногеномных исследований, проведенных, в частности, на когорте японских больных, полиморфные варианты этого хромосомного региона не были идентифицированы как маркеры риска развития БП. Согласно результатам нашего исследования, полиморфные варианты МAРГ-региона оказались ассоциированными с БП преимущественно в этнической группе татар, при этом маркерами риска развития заболевания выступили те же аллельные варианты, которые были выявлены и при полногеномных анализах ассоциации с БП. Противоречивый результат был обнаружен для полиморфного локуса rs 11012, для которого в этнической группе русских с риском развития БП ассоциированным оказался аллель *А, в то время как, по данным GWAS, этот аллель является протективным для развития заболевания среди европейцев в целом.

Таким образом, проведенная репликация данных полногеномных анализов ассоциации с БП в трех этнических группах населения РБ, каждая из которых характеризуется своеобразием генофонда, выявила наиболее значимые результаты ассоциации с БП в этнических группах русских и татар, в генофонде которых существенную долю составляет европеоидный компонент. В популяции башкир, в генофонде которых значительную долю представляет монголоидный компонент, ни с одним из исследованных локусов ассоциация с БП не подтверждена.

т2

В целом, маркеры риска развития БП в трех этнических группах населения РБ, выявленные на основе анализа генов-кандидатов ядерного генома и репликации GWAS, представлены в табл. 2. Обобщая полученные результаты, можно заключить, что наследственную предрасположенность к БП обусловливает целый комплекс генетических факторов, которыми могут являться как более функционально значимые изменения структуры генов, участвующих в процессах функционирования нейронов мозга — мутации, — приводящие к возникновению моногенных форм БП, так и менее опасные нарушения — полиморфные варианты генов, встречающиеся с определенной частотой как среди больных БП, так и среди здоровых индивидуумов. Исследования ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов, вовлеченных в известные звенья патогенеза БП, достаточно информативны и позволяют определять роль исследуемых функциональных систем для БП в целом и выявлять конкретные маркеры риска и антириска развития заболевания. Проведенные полногеномные исследования ассоциации с болезнью Паркинсона позволили выявить целый ряд полиморфных вариантов генома человека, многие из которых оказались локализованными в уже известных генах, имеющих отношение к БП, а многие — в хромосомных локусах, включающих гены, ранее не привлекавшие внимания исследователей при изучении генетических основ данного заболевания. Выявляемые ассоциированные с БП полиморфные варианты генов-кандидатов и независимых хромосомных локусов могут являться как непосредственными участниками патогенеза БП, так и быть случайно сцепленными с какими-либо другими, неизвестными, мутациями в генах и представлять собой лишь маркеры риска развития заболевания. Существующая популяционная гетерогенность характера полиморфизма многих полиморфных ДНК-локусов обусловливает различия и в характере их ассоциаций с многофакторной патологией, в том числе и с БП. Поэтому этническая однородность сравниваемых выборок больных и контроля при анализе ассоциаций является крайне важной. Выявленные этноспецифические генетические маркеры БП могут быть использованы для раннего определения риска развития заболевания у жителей соответствующих регионов с целью его профилактики. Полученные на сегодняшний день результаты ассоциативных генетических исследований с БП являются основой для продолжения более углубленного исследования роли различных генов в патогенезе БП, их взаимодействия между собой, а также в совокупности с различными факторами окружающей среды, что, в целом, направлено на разработку новых методов лечения и профилактики этого тяжелого нейродегенеративного заболевания.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также