Моделирование FUS-протеинопатий у млекопитающих

Декабрь 4, 2015 / Комментарии 0

Первая трансгенная модель у млекопитающих на основе сверхэкспрессии FUS была получена на крысах. Чтобы избежать возможной токсичности FUS во время эмбрионального развития, был использован доксициклин-зависимый промотор. Трансгенным самкам на период беременности и кормления добавляли в воду доксициклин, который подавлял активность промотора и, соответственно, экспрессию FUS. Несмотря на накопление белка FUS в спинном и головном мозге трансгенных крыс FUS-позитивных включений обнаружено не было. Тем не менее, у крыс, экспрессирующих FUS R521C, были идентифицированы убиквитин-позитивные/FUS-негативные включения в нейронах коры и в спинном мозге. Как правило, крысы линии R521C умирали рано, в возрасте 2-3 месяцев, от паралича, тогда как у трансгенных крыс, экспрессирующих немутированный FUS, в возрасте 1 год моторная функция оставалась нормальной. У последних, однако, была зарегистрирована гибель нейронов в лобной коре и некоторых других участаках мозга, а также нарушение памяти и способности ориентироваться в пространстве. Эти данные позволили предположить, что сверхэкспрессия как белка FUS дикого типа, так и его мутанта приводит к нейродегенерации. Тем не менее, мутантный белок FUS R521C более токсичен для нейронов. Для белка FUS дикого типа требовалось больше времени для накопления в цитоплазме на уровне, достаточном для проявления токсичности и для образования включений.

Первая мышиная модель с повышенной экспрессией FUS и его мутантов была создана с помощью двухстороннего введения в мозг новорожденным мышам аденовирусного вектора (rAAV). В качестве мутантных вариантов использовались R521C и FUS1-478, обе мутации ассоциированы с БАС. При мутации (g.10747A>G; IVS13-2A>G) нарушается сплайсинги удаляется экзон 14, что приводит к образованию изоформы FUS1-478 с удаленным NLS и частью домена RGG3. Данная мутация была обнаружена при ранней форме заболевания, с дебютом в 20 лет и продолжительностью жизни после дебюта 22 месяца. Забор тканей для анализа производили через три месяца после инъекции rAAV. Экспрессия FUS1-478 у мышей также способствовала накоплению белка в цитоплазме и образованию нерастворимых включений FUS, также положительно окрашивающихся на убиквитин, р62, интернексин-α и РАВР-1. Авторы работы сделали вывод, что повышенная концентрация FUS в цитоплазме может влиять на метаболизм РНК, способствуя, например, вовлечению других РНК-связывающих белков, таких как TAF15 и РАВР-1, в агрегацию. Для сравнения, при экспрессии FUS дикого типа и мутантной формы FUS R521C патологические включения не образовывались, возможно, это связано с более медленным накоплением белка в цитоплазме.

Трансгенная мышиная модель на основе сверхэкспрессии FUS под контролем РrР промотора была получена и охарактеризована в работе. Гемизиготные hFUS+/- трансгенные животные были нормальными, в том числе у них не было зарегистрировано уменьшения продолжительности жизни. При этом гомозиготные животные hFUS+/+ развивали выраженный моторный фенотип и имели сниженную продолжительность жизни. Суммарная экспрессия FUS (человеческого и мышиного) в нервной системе гемизиготных мышей была в 1,7 раза выше по сравнению с эндогенным FUS у мышей дикого типа, и в нервной системе гомозиготных особей — в 2,0 раза выше, чем у гетерозиготных животных, указывая на регуляцию экспрессии FUS по принципу отрицательной обратной связи. В гомозиготных животных hFUS+/+FUS агрегировал, формируя кольцеподобные около-ядерные убиквтин-негативные включения в нейронах головного и спинного мозга. Агрегацию FUS в гомозиготных животных и отсутствие патологии у гемизиготных животных можно объяснить диспропорциональным увеличением содержания белка FUS в цитоплазме у гомозигот, так как для агрегации (и токсического воздействия), по-видимому, необходима определенная пороговая концентрация белка. Если вернуться к гипотезе, что белки/РНК, в норме взаимодействующие с FUS, могут препятствовать его агрегации, то пороговая концентрация может достигаться при «истощении» данных молекул и приводить к агрегации «свободного» FUS.

Согласно данным, полученным с использованием различных моделей у беспозвоночных и млекопитающих, нарушения цитоплазматических функций FUS, в том числе и в отсутствие видимых белковых включений, достаточно, чтобы вызвать патологию и фенотипические проявления токсичности. Тем не менее, в этих моделях невозможно отделить негативный эффект функционального, но делокализованного FUS от непосредственного влияния его агрегированных форм. Чтобы ответить на этот вопрос, была создана трансгенная мышиная модель на основе укороченной формы белка FUS человека, FUS 1-359, в которой отсутствовали домены, участвующие в связывании РНК — RGG2, RGG3 и «цинковый палец». У гемизиготных животных, экспрессирующих FUS 1-359 в нервной системе под контролем Thyl промотора, уровень белка FUS 1-359 был существенно ниже, чем эндогенного FUS. Тем не менее, этого уровня экспрессии было достаточно для развития БАС-подобного фенотипа. Животные достигали терминальной стадии заболевания (паралич конечностей, неспособность передвигаться) в возрасте 3-4 месяцев, при этом у них наблюдалась избирательная гибель мотонейронов ядер ствола головного мозга, денервация и атрофия мышц и повреждение нервов. Более того, у животных развивалась FUS-протеинопатия с многочисленными FUS-позитивными/убиквитин-негативными и FUS/убиквитин-позитивными включениями в пораженных участках нервной системы, главным образом в мотонейронах. Эта работа позволила заключить, что агрегация FUS как таковая, без прямого воздействия на метаболизм РНК, может стать причиной патологии, типичной для FUS-протеинопатий у человека.

В ходе работ при поддержке программы «ФНМ» были получены обширные данные по механизмам физиологической и патологической агрегации белка FUS и его роли в СГ. Наряду с другими исследовательскими группами было описано цитоплазматическое перераспределение мутированных форм FUS и зависимость возраста дебюта заболевания от степени делокализации белка. Последующие исследования укороченных, с делециями в С-концевом участке белка, форм FUS указали на повышение агрегационных свойств белка при прогрессивном нарушении способности к связыванию РНК. Дальнейшая работа в этом направлении позволила установить, что изменение агрегационных свойств связано со снижением способности FUS к секвестрации в стресс-гранулы. Известно, что FUS-протеинопатии плохо поддаются моделированию in vivo — агрегации белка в нервной системе животных очень трудно достичь, поэтому мы предположили, что использование формы с нарушенным РНК-связыванием, которая быстро агрегирует в клеточных культурах, позволит эффективно воспроизвести FUS-протеинопатию у млекопитающих. В сотрудничестве с Институтом биологии гена РАН и Кардиффским университетом была создана трансгенная мышиная модель на основе нейроспецифической экспресии FUS с нарушенным РНК-связыванием, которая подтвердила ведущую роль агрегации FUS и образующихся белковых включений в развитии FUS-протеинопатии. Исследования роли FUS в различных HYG-комплексах позволили установить, что FUS является важным компонентом ядерных параспеклов (англ. paraspeckles) — функция белка, нарушаемая мутациями, ассоциированными с БАС. Последующие исследования цитоплазматических агрегатов мутантного белка FUS позволили установить ряд важных отличий от СГ и выдвинуть гипотезу о механизмах образования патологических агрегатов при FUS-протеинопатиях.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также