Моделирование FUS-протеинопатий у беспозвоночных и рыб

Декабрь 4, 2015 / Комментарии 0

Для повышенной экспрессии гена jus и его мутантов у дрозофилы была использована дрожжевая бинарная система экспрессии Gal4/UAS. Этот метод заключается в том, что в геном дрозофилы интегрируется кассета, содержащая исследуемый ген, поставленный под дрожжевой промотор UAS (upstream activation sequence). Так как UAS не узнается факторами транскрипции дрозофилы, для активации экспрессии гена эта линия скрещивается с другой линией, несущей интегрированную кассету с дрожжевым фактором транскрипции Gal4. Для экпрессии генов в отдельных тканях использовались тканеспецифичные факторы транскрипции под контролем GAL4: для повсеместной экспрессии — act5C-Gal4, для экспрессии в эмбриональных нервных клетках — Elav-Gal4, в мотонейронах -D42-Gal4, в фоторецепторах глаза — GMR-Gal4. По этой же схеме активировалась экспрессия ортолога jus дрозофилы под названием cabeza (caz). Несмотря на то что у дрозофилы белок Cabeza синтезируется в большом количестве в мозге во время эмбриогенеза, использование бинарной Gal4/UAS-системы позволяет поддерживать экспрессию гена на определенном уровне. Кроме этого, был использован генетический нокдаун caz с помощью РНК-интерференции.

В ряде работ было показано, что повышенная повсеместная экспрессия FUS/CAZ, в том числе и мутантного FUS, токсична и вызывает прогрессирующую дисфункцию в разных тканях, приводя к моторным нарушениям как у личинок, так и у взрослых особей, апоптозу и снижению продолжительности жизни. Тем не менее, в ряде исследований экспрессия нормального FUS не оказывала особого влияния на фенотип мух. Необходимо отметить, что при тканеспецифичной экспрессии токсичность FUS существенно зависела от типа клеток. Так, в одной из работ мутации FUS R518K, R521H и R521C приводили к нарушению организации омматидий при экспрессии в фоторецепторах глаза, а также летальности на стадии куколки при экспрессии в нейронах. В другом исследовании повышенная экспрессия нормального FUS, FUS R521G и CAZ также приводила к повреждениям омматидия, которые прогрессировали с возрастом, а при нейрональной экспрессии значительно нарушалась подвижность личинок и взрослых особей, усиливался апотоз в мотонейронах, сокращалась продолжительность жизни. Летальность на стадии куколки наблюдалась только при повышенной экспрессии гена caz. Результаты по нокдауну CAZ с помощью РНК-интерференции также весьма противоречивы. В работе он не оказал влияния на двигательную активность мух, в то время как в работе при делеции гена caz нарушалось формирование омматидий, уменьшалась подвижность как личинок, так и взрослых особей, нарушались связи между нейронами, сокращалась продолжительность жизни. Следовательно, белок CAZ необходим для нормального формирования глаз и функционирования мотонейронов, по крайней мере у дрозофилы.

Совершенно неожиданные результаты получены в работе относительно цитоплазматической токсичности FUS. Возможно, это связано с тем, что в данной работе были использованы специфические для дрозофилы NES и NLS, что не было учтено в других экспериментах. В данной работе при нарушении локализации FUS в ядре из-за мутации FUSY526F наблюдалось подавление токсичности. Следует отметить, что тирозин Y526 на С-конце подвергается фосфорилированию тирозинкиназой и присутствует как в FUS, так и в CAZ. При удалении NLS в комбинации с RGG3-доменом (FUS1-453) токсичность FUS полностью подавлялась и особи сохраняли жизнеспособность. Противоположные результаты получили в работе, где было отмечено уменьшение токсичности при накоплении FUS в ядре. Возможно, это было также связано с тем, что у белка был удален NES, который расположен внутри РНК-связывающего мотива, что могло нарушить взаимодействие с РНК и таким образом уменьшить токсичность. P. Хи с сотрудниками показали, что при полном удалении NLS белок накапливался в цитоплазме, что привело к незначительному снижению подвижности трансгенных животных, при этом выживаемость особей была соизмерима с таковой для дикого типа, а фенотип глаз практически не отличался от дикого типа.

В работе у Drosophila было показано, что растворимость полноразмерного немутированного белка FUS человека зависит от типа клеток, где происходит его экспрессия. Так, например, в клетках сетчатки глаза белок в основном присутствовал в растворимой форме, при этом наблюдалось незначительное изменение фенотипа глаза. В то же время, при повышенной экспрессия в нейронах существенная фракция FUS образовывала нерастворимые формы на фоне отсутствия FUS-позитивных включений в цитоплазме, при этом сильно сокращалась продолжительность жизни дрозофил. Нейротоксичность в значительной степени ослабляется шаперонами за счет увеличения содержания растворимого белка FUS. Р. Хи с коллегами не удалось достичь агрегации и образования включений для мутанта FUS R522G и белка FUS дикого типа у дрозофилы, тогда как в работе упоминались убиквитин-позитивные включения у трансгенных мух, экспрессирующих FUS человека.

У нематод Caenorhabditis elegans трансгенные животные были получены с помощью микроинъекций вектора, в котором FUS был поставлен под контроль промоторов везикулярного ГАМК-транспортера (unc-47) или пан-нейрональных генов (une-119, Prgef-l и др.).

Для исследования механизма токсичности в мотонейронах А. Ваккаро и др. использовали трансгенных С. elegans, у которых экспрессия гена FUS и мутанта FUS S57del осуществлялась под контролем промотора unc-47. Мутация FUS S57del была обнаружена у больных при спорадической форме БАС. Серин, удаленный при данной мутации, является потенциальным сайтом фосфорилирования и находится в пределах прионоподобного домена. Двигательные нарушения у трансгенных нематод наблюдались только по достижении ими половозрелого возраста, дегенерация мотонейронов нарастала с возрастом, при этом при экспрессии FUS S57del мутантов паралич наступал намного быстрее, без видимого эффекта на продолжительность жизни, которая была соизмерима с нетрансгенными животными. Более того, FUS S57del был способен образовывать нерастворимые агрегаты, в то время как немутированный FUS не появлялся в нерастворимой фракции. Тем не менее, в последующих работах на трансгенной модели Danio rerio патогенность мутации S57del была поставлена под сомнение, что, возможно, связано с введением мРНК FUS у последних на стадии эмбриона.

T. Мураками с коллегами создали ряд моделей у С. elegans с использованием FUS дикого типа и мутантных вариантов R514G, R521G, R522G, R524S и P525L, а также укороченных форм FUS 1-513 и FUS 1-501, под контролем пан-нейронального промотора Рrgef. FUS был также помечен GFP. В этих условиях FUS дикого типа и варианты R514G и R521G накапливались в в ядре, FUS R522G был диффузно распределен в ядре и цитоплазме, и все остальные варианты присутствовали главным образом в цитоплазме. При этом при экспрессии FUS с мутациями R514G и R521G, которые у человека ассоциированы с менее агрессивным течением заболевания, нематоды фенотипически не отличались от особей, экспрессирующих нормальный FUS. Мутация P525L и удаление NLS (FUS1-513 и FUS 1-501) приводили к более быстрой прогрессии моторных нарушений и более ранней летальности по сравнению с нормальным FUS. Также у этих особей с возрастом образовывались FUS-позитивные гранулы, и их образование ускорялось при действии стресса. Более того, после окончания действия стресса наступала прогрессирующая моторная дисфункция, чего не наблюдалось для особей, экспрессирующих FUS WT, FUS R514G и FUS R521G, которые быстро восстанавливались после теплового шока.

Для исследования возможной потери ядерной функции при делокализации FUS в цитоплазму Т. Мураками с сотрудниками создали «двойных» трансгенных животных. Нормальный FUS и FUS P525L, меченые разными флуорохромами, ко-экспрессировались в одном животном. Однако токсический эффект FUS P525L не ослаблялся в присутствии нормального белка, на основании чего был сделан вывод, что накопление и агрегация FUS в цитоплазме являются более нейротоксическими, чем его отсутствие в ядре.

Суммируя вышесказанное, даже с учетом различия в методологических подходах и, следовательно, некоторого расхождения в результатах и их интерпретации, повышенная экспрессия FUS человека и его мутантов, ассоциированных с БАС, как правило, токсична, приводит к сокращению продолжительности жизни, моторным нарушениям, повреждению аксонов и гибели клеток. В разных видах беспозвоночных уменьшение растворимости при повышенной экспрессии белка наблюдалось во всех случаях. Тот факт, что у беспозвоночных было достаточно легко достичь агрегации FUS, может быть связан с эффектом «окружения». Как уже упоминалось ранее, FUS может быть защищен от агрегации в цитоплазме за счет включения в СГ и прочие РНП-комплексы, в то время как потеря способности связывать РНК и, следовательно, входить в состав подобных комплексов способствуют агрегации. Учитывая, что FUS человека экспрессировался в отдаленных организмах, таких как дрозофила, можно предположить, что доступный пул предполагаемых белков-партнеров по РНП-комплексам мог быть ограничен, что способствовало агрегации «свободных», не включенных в комплексы молекул FUS. Можно сделать вывод, что образование включений не является необходимыми для проявления нейротоксичности. Таким образом, описанные выше модели позволили подтвердить нейротоксичность олигомеров FUS, однако для дальнейшего понимания механизмов нейротоксичности необходимо было моделирование у более высокоорганизованных, долгоживущих животных.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также