Математический метод извлечения тел нейронов в областях черной субстанции и аркуатного ядра срезов головного мозга грызунов

Разработанный метод предназначен для выделения множества мелких информативных протяженных объектов с хорошо различимым по яркости включением овальной формы на микроскопических изображениях фронтальных срезов КЧС и АЯ и подсчета их морфометрических характеристик. Результатом является двоичное изображение контуров выделенных объектов и их включений и список значений характеристик, вычисленных для каждого выделенного объекта. Метод основан на совместном использовании процедур математической морфологии, сегментации и классификации микроскопических изображений.

Основной особенностью метода является то, что после предварительной обработки изображений проводится итерационный анализ микроскопических изображений с целью выделения различных классов объектов, включающий 5 процедур: 1) объекты, не являющиеся нейронами, исключаются на этапе применения классификатора; 2) после классификации выделяется специальный класс объектов

— «слипшиеся нейроны»; их анализ сводится к построению границы между двумя нейронами по центру области из соприкосновения; 3) проведение сегментации обеспечивает выделение «хороших» («правильной формы») нейронов; 4) анализ нейронов с тонкой сомой, у которых частично «стерта» граница и ядро соприкасается с фоном; 5) удаление отростков нейронов.

Комбинированный метод содержит следующие основные этапы: (1) предварительная обработка МИН: (1.1) фильтрация МИН нерезкой маской, (1.2) нормализация МИН, (1.3) морфологическое закрытие с помощью реконструкции, (1.4) бинаризация МИН; (2) анализ МИН: 2.1) сегментация МИН, (2.2) классификация выделенных объектов, (2.3) выделение «нейронов», (2.4) прослеживание границ «нейронов», (2.5) отсечение отростков «нейронов», 2.6) построение границ ядер выделенных «нейронов»; (3) морфологическая характеризация нейронов.

Для АЯ алгоритмическая схема метода аналогична построенной для КЧС. Отличия заключаются лишь в значении параметров для пункта 1.4 и способе обучения алгоритма классификации для пункта 2.2.

Алгоритмическая схема, реализующая разработанный метод выделения и идентификации объектов, включает следующие этапы.

Этап 1. Предварительная обработка МИН.

Шаг 1.1. Фильтрация МИН нерезкой маской.

На данном шаге происходит увеличение общей резкости МИН, что позволяет повысить точность разделения близко расположенных нейронов на дальнейших этапах. Нерезкое маскирование усиливает локальный контраст изображения на тех участках, где изначально присутствовали резкие изменения градаций цвета, что и помогает сохранять границы между нейронами. На рис. 10a представлено изображение, полученное после применения к исходному изображению фильтра нерезкой маски.

Шаг 1.2. Нормализация.

На данном шаге происходит переход к тоновому представлению МИН для нормализации различия в окраске препаратов (рис. 10б).

Шаг 1.3. Фильтрация МИН с применением морфологического закрытия при помощи реконструкции.

В результате данного шага метода с тонового МИН исчезают мелкие шумовые объекты, в то время как массивные объекты, в том числе нейроны, не претерпевают существенных изменений в своей форме. Модифицированное изображение представлено на рис. 10в.

Применение морфологического фильтра обусловлено тем, что на исходных МИН присутствуют шумовые объекты, которые, с одной стороны, не принадлежат к объектам фона, с другой — не являются целевыми объектами. Шум на изображении образуется за счет частей нейронов (часть оболочки нейрона), которые полностью не попали на срез, либо за счет попадания на срез терминалей. Наличие шумовых объектов на изображении искажает результаты классификации, кроме того, они могут повлиять на форму выделенных объектов в случае наложения.

Для морфологической обработки изображений был выбран фильтр «закрытие при помощи реконструкции», т.к. после применения этого фильтра сохраняются границы объектов, прошедших фильтрацию.

После морфологической фильтрации на тоновом изображении остаются крупные объекты переднего плана, четко отделимые от фона, однако среди оставшихся объектов могут присутствовать также крупные шумовые объекты. В результате применения фильтра мелкие детали становятся более светлыми за счёт своих размеров, тогда как крупные объекты, такие как целые нейроны с ядром, напротив, становятся более темными.

Шаг 1.4. Бинаризация.

На данном шаге метода осуществляется переход от тонового МИН к бинарному для последующей сегментации интересуемых объектов. Бинарное изображение представлено на рис. 10г. Бинаризация изображения осуществляется при помощи алгоритма пороговой обработки с адаптивным порогом. Адаптивный порог подбирается по методу Н. Отсу.

Анализ срезов АЯ показал, что изображения в АЯ более контрастные и разница в яркостях между фоном и нейронами более существенная, чем у изображений в КЧС. В связи с этим порог, вычисленный по методу Отсу, умножается на некоторую нормирующую константу. Значение константы (0,74) было найдено экспериментально по результатам бинаризации изображений из обучающей выборки.

Этап 2. Анализ МИН.

Шаг 2.1. Сегментация МИН.

На данном шаге происходит выделение похожих на нейроны объектов из выделенных связных компонент бинарного изображения. После проведения сегментации МИН некоторые нейроны, находящиеся очень близко друг к другу на исходном изображении, могут «слипнуться» так, что граница между ними не прослеживается, поэтому в одной связной компоненте может находиться несколько нейронов, что будет учтено позже на стадии классификации и на стадии выделения границ объектов.

Проводится исключение объектов по критериям формы и размеров нейронов, а именно — происходит отсечение лишних объектов по размерам: а) сверху с очень высоким порогом, чтобы убрать большие области, заведомо не являющиеся нейронами, но при этом оставить фрагменты, соответствующие «слипшимся» нейронам;

б) снизу с маленьким нижним порогом, чтобы убрать заведомый шум. Далее выбираются области с выделенными объектами, в которых для последующей классификации строятся минимальные квадраты, описывающие объекты.

Шаг 2.2. Классификация выделенных объектов на два класса — «нейроны» и «прочие объекты».

Задача распознавания нейронов решалась с помощью линейного классификатора, основанного на вычислении признаков гистограмм ориентированных градиентов (HOG-признаки). Это обусловлено следующими причинами: во-первых, скорость работы данного типа классификатора является довольно высокой для задачи распознавания нейронов; во-вторых, при тестировании HOG-классификатор показал лучшие результаты по сравнению с другими известными классификаторами.

Параметры алгоритма классификации подбираются экспериментально по качеству классификации на обучающей выборке. Для обучения классификатора выбран метод опорных векторов (SVM) с линейным ядром. Размер скользящего окна — 32×32 пикселов (исходя из того, что в него должен помещаться любой нейрон обучающей выборки).

Получение признакового описания нейронов из обучающей выборки проводится следующим образом: 1) квадратная область приводится к размеру 32×32 пикселей и разбивается на ячейки 8х8 пикселей; 2) каждая ячейка описывается гистограммой направлений градиентов (квантованным по 8 направлениям); 3) ячейки объединяются в блоки размера 2×2 пиксела с перекрытием; 4) производится нормализация гистограммы направлений в каждом из блоков; 5) значения частот гистограмм по каждой из ячеек и по всем блокам записываются в общий вектор, характеризующий данную область.

Классификатор применяется при разных разрешениях к квадратным фрагментам МИН, которые содержат связные области, выделенные на предыдущем шаге. Данный подход позволяет определить наличие как одного, так и нескольких нейронов в одной связной области.

Точность обученного классификатора на тестовой выборке составила: 5% (7% в случае АЯ) — ошибка первого рода (нейроны, отнесенные к классу «прочие объекты»), 15% (20% в случае АЯ) — ошибка второго рода (не-нейроны, идентифицированные как «нейроны»). Точность классификатора может быть улучшена за счет увеличения обучающей выборки и применения техники бутстрэп-оценок для выбора фоновых объектов.

На рис. 11 представлены МИН с отмеченными белым цветом контурами выделенных нейронов. Черным обозначены контуры объектов, не попавших в класс нейронов.

Шаг 2.3. Выделение «нейронов».

На данном шаге проводится удаление всех связных компонент в соответствии со списком минимальных квадратов, описывающих «прочие объекты». В реальности обработка одной связной компоненты и подача ее на вход классификатору одновременно (изображение обрабатывается фрагментарно), поэтому если связная компонента не содержит нейроны, то она автоматически убирается из списка связных областей на шаге 2.2. Далее проверяется количество выделенных «нейронов» в каждой связной компоненте.

Шаг 2.4. Прослеживание границ нейронов.

При наличии в одной связной компоненте нескольких нейронов проводится разделение «слипшихся» нейронов. Связная компонента, предварительно не распознанная как нейрон и подходящая по размерам, проверяется на наличие областей белого цвета, полностью входящих в нее. При наличии нескольких областей проводятся серединные перпендикуляры к линии, соединяющей их центры. Эти перпендикуляры будут являться частью границы новых нейронов.

После того как граница нового кандидата в нейроны выделена, строится описывающий его минимальный квадрат и запускается классификатор, который определяет, принадлежит вновь выделенный объект к классу нейронов или нет.

Стоит отметить, что в случае АЯ данная проблема встречается очень редко, т.к. нейроны, расположенные в этой области мозга, более разрозненные по сравнению с нейронами в КЧС. Данный шаг исключается из алгоритмической схемы метода.

На данном шаге также проводится сравнение прослеженной границы связной области и минимальной выпуклой оболочки: при существенном отличии участка выпуклой оболочки от прослеженной границы связной области в качестве границы берется участок выпуклой оболочки; при совпадении или незначительных отличиях в качестве границы берется граница связной области.

Шаг 2.5. Отсечение отростков нейронов.

Отсечение отростков нейронов проводится путем операции открытия при помощи реконструкции с большим радиусом структурирующего элемента. На рис. 12 представлен фрагмент МИН в области КЧС, на котором выделены контуры объектов, отнесенных к классу «нейроны». Результаты выделения нейронов для специальных случаев представлены на рис. 13: 1) «слипшиеся» нейроны (см. рис. 13а); 2) нейроны с отростками (см. рис. 13б); 3) нейроны с нерезкой границей (см. рис. 13в).

Из области, принадлежащей нейронам, заключенной внутри границы, исключаются пикселы, принадлежащие связной области. Оставшиеся пикселы по определению принадлежат ядру.

Этап 3. Морфологическая характеризация нейронов.

На данном этапе проводилось формирование необходимого признакового пространства для характеризации нейронов. Биологи-эксперты включили в признаковое описание нейрона среднюю яркость, периметр, площадь, фактор формы, оптическую плотность, количество.

Разработанный метод анализа МИН обладает сходимостью, устойчивостью к малым вариациям исходных данных, имеет квадратичную вычислительную сложность. Метод программно реализован и экспериментально исследован для автоматизации наполнения и исследования доклинических моделей БП экспериментальными данными в ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова Российской академии наук».

Экспериментальные исследования проводились на 58 срезах головного мозга одного животного. Точность полученных результатов оценивалась путем проверки гипотез о совпадении распределений (нулевая гипотеза) характеристик нейронов при автоматическом выделении и при выделении вручную по критерию Колмогорова-Смирнова.

Точность полученных результатов также оценивалась путем подсчета экспертами процента правильно выделенных объектов после автоматической обработки изображений.

Были проведены следующие эксперименты: 1) сравнение ручного и автоматического выделения нейронов на срезах головного мозга: а) по наличию правильно выделенных нейронов, б) по наличию объектов, выделенных как нейрон, но таковыми не являющимися, в) по количеству нейронов, не выделенных при автоматическом режиме; 2) сравнение ручного и полуавтоматического выделения нейронов; 3) сравнение автоматического и полуавтоматического выделения нейронов. Полуавтоматическая обработка включала в себя последовательное применение ПО для автоматического выделения нейронов и дальнейшую коррекцию результатов специалистами. Результатами сравнения режимов работы являлись оценки первого и второго рода (оценка первого рода — процент невыделенных нейронов, оценка второго рода — процент выделенных объектов, не являющихся нейронами).

Срезы обрабатывались последовательно один за другим (на первом этапе проводилось ручное выделение нейронов, на втором этапе выполнялось автоматическое выделение, на третьем этапе запускалось автоматическое выделение с последующей корректировкой результатов в полуавтоматическом режиме).

Результаты экспериментов показали отсутствие ошибки 2-го рода. Далее приведен анализ ошибки 1-го рода в трех экспериментах.

В результате сравнения автоматического и полуавтоматического режимов работы ПО было получено, что математическое ожидание разницы в количестве выделенных нейронов в двух режимах равно -8,16. Среднеквадратичное отклонение равно 7,5. Математическое ожидание и среднеквадратичное отклонение — это величины одного порядка, что говорит о сильной рандомизации данных. Это объясняется тем, что представленные изображения имеют большой разброс по яркости и контрасту, и на изображениях встречается шум разной структуры (возникают случаи, когда нейроны полностью сливаются с шумом и становится практически невозможно отделить одно от другого). Средняя ошибка 1-го рода соответственно равна 0,082.

В результате сравнения автоматического и ручного режимов работы выявлено, что средняя ошибка первого рода равна 0,065, что меньше ошибки при сравнении с полуавтоматическим режимом выделения. Это связано с тем, что вручную эксперты также ошибаются и не могут отметить все нейроны из-за большого объема работы, однако при полуавтоматическом режиме им остается выделить нейронов на порядок меньше. Средняя ошибка выделения -6,407. Значение дисперсии на порядок больше, что снова говорит о рандомизации данных.

В результате сравнения ручного и полуавтоматического режимов работы ПО выявлено, что среднее значение отклонения количества выделенных нейронов в двух режимах равно -1,763 и среднеквадратичное отклонение -5,35. Средняя величина ошибки первого рода равна соответственно 0,018. По значениям этих величин можно сказать, что ручной режим выделения нейронов мало отличается от полуавтоматического режима.

Было проведено сравнение времени, затраченного специалистом на обработку одного изображения КЧС головного мозга в ручном, автоматическом и полуавтоматическом режимах работы программы. В качестве эталонных брались изображения, содержащие более 60 нейронов. В ручном режиме среднее время выделения всех нейронов на одном изображении заняло 5,3 минуты, в автоматическом режиме -10 секунд, в полуавтоматическом — 35 секунд.

Ручной режим обработки занимает существенно больше времени, чем автоматический или полуавтоматический. Время работы эксперта в полуавтоматическом режиме в 3 раза больше работы программы в автоматическом режиме. Ошибка 1-ого рода, равная 0.08299525, при сравнении полуавтоматического и автоматического режимов работы превышает заданный биологами порог в 5%, а время полуавтоматического режима работы несущественно больше. Поэтому рекомендовано проводить выделение нейронов в полуавтоматическом режиме.

Точность полученных результатов также оценивалась путем сравнения средних морфофункциональных характеристик при автоматическом и ручном выделении нейронов на случайно выбранных срезах головного мозга (было выбрано 5 срезов головного мозга). Усредненные значения характеристик объектов, выделенных автоматически и вручную, приведены в табл. 2. В ней представлены также значения корреляции между подсчитанными в ручном и автоматическом режимах характеристиками. Результаты подтверждают, что автоматическое выделение приближено к ручному: различия между яркостью и площадью выделяемой области в пределах допустимого, а большее различие между периметрами и фактором формы объектов объясняется тем, что вручную точную границу провести очень сложно.

В ходе проведенных экспериментальных исследований были подтверждены следующие характеристики разработанных алгоритмов: 1) алгоритмы обеспечивают анализ и распознавание изображений нейронов на двухмерных срезах головного мозга экспериментальных животных; 2) автоматизированный анализ изображений нейронов в соответствии со статистической оценкой критерия Колмогорова-Смирнова проводится с точностью, соизмеримой с точностью визуального анализа изображений нейронов, проводимого при изучении болезни Паркинсона без использования средств автоматизации анализа изображений.