Компонентный спектральный ВЭЖХ-анализ хлороформного экстракта ретинального пигментного эпителия

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

Для проведения сравнительного анализа флуоресцентных свойств отдельных флуорофоров был получен суммарный хлороформный экстракт РПЭ из 5-7 кадаверных глаз доноров, близких по возрасту и без видимых патологических признаков в РПЭ.

ВЭЖХ-анализ был проведен на двух последовательно соединенных детекторах — спектрофотометрическом и флуоресцентном. Количество одного образца было достаточным для тестирования поглощения отдельных продуктов в смеси на разных длинах волн и проведения флуоресцентного анализа при разных длинах волн возбуждения флуоресценции и эмиссии. Другими словами, во всех хроматограммах, полученных при детектировании продуктов в смеси, содержатся данные о составе и относительном флуоресцентном вкладе отдельных компонентов одного и того же образца. На рис. 9 представлены хроматограммы с детектированием по поглощению (А, Б и В — 1) и по флуоресценции (А, Б и В — 2 и 3). Детектирование по поглощению проводили на длинах волн 340, 430 и 510 нм (А, Б и В, соответственно), где поглощает большинство бисретиноидов. Флуоресценцию возбуждали на этих же длинах волн, а эмиссию детектировали для А и Б эксперимента при 500 и 600 нм, для В эксперимента — при 600 и 650 нм. Как видно из рисунка, наибольшая интенсивность поглощения всех детектируемых компонентов хлороформного экстракта наблюдается на длине волны 340 нм (А — 1). На длине волны 430 нм интенсивность падает в среднем в 2 раза (Б — 1), а на длине волны 510 нм — примерно в 4 раза (B — 1) по сравнению с первой хроматограммой с детектированием на длине волны 340 нм. На всех хроматограммах можно выделить три группы пиков: первая группа — A2Eoх,deg (продукты фотоокисления и фотодеградации А2Е), вторая — А2Е и iso-A2E, третья группа — A2Emod (продукты модификации А2Е). Можно отметить, что с увеличением длины волны детектирования уменьшается и количество детектируемых продуктов в каждой группе. В табл. 3 представлены данные по относительному содержанию компонентов каждой из групп в смеси на разных длинах волн детектирования по поглощению. Как можно видеть из табл. 3, относительный вклад А2Е и iso-A2E в суммарное поглощение всех детектируемых продуктов в хлороформном экстракте РПЭ на разных длинах волн детектирования (340, 430, 510 нм) является наименьшим по сравнению с остальными группами.

р9 т3

При анализе хроматограммы, полученной при детектировании флуоресценции (возбуждение длинами волн 340, 430 и 510 нм) (см. рис. 9А, В и С — 2 и 3), видно, что интенсивность флуоресценции группы пиков А2Еох,deg несравнимо выше, чем интенсивность всех остальных компонентов хлороформного экстракта РПЭ, независимо от длины волны возбуждения флуоресценции и длины волны детектирования эмиссии. Относительный вклад группы детектируемых продуктов А2Еох,deg в суммарную флуоресценцию всех детектируемых продуктов составляет в среднем 81-96% (табл. 4). Как и в случае поглощения, наибольшая интенсивность эмиссии наблюдается на хроматограмме при возбуждении флуоресценции длиной волны 340 нм (см. рис. 9А — 2). Интенсивность флуоресценции этой группы детектируемых веществ на длине волны 500 нм составляет около 96% (см. табл. 4) от общего вклада всех компонентов, в то время как А2Е — только около 1%. Этот результат хорошо коррелирует с нашей более ранней работой. При возбуждении флуоресценции длиной волны 430 и 510 нм и детектировании эмиссии на длинах волн 500, 600 и 650 нм флуоресценция А2Е и его изоформ практически не регистрируется. При возбуждении флуоресценции длинами волн 430 и 510 нм интенсивность эмиссии всех детектируемых продуктов, как и их поглощение, достаточно резко падает. Как уже отмечалось выше, основной вклад в суммарную флуоресценцию вносит эмиссия группы А2Еоx,deg (см. рис. 9Б и В — 2, 3, табл. 4). Следует отметить, что при детектировании эмиссии на длине волны 600 и 650 нм (см. рис. 9А-2, Б-2 и 3) можно наблюдать достаточно широкий и интенсивный пик (возможно, это несколько продуктов), появляющийся на 6-7-й минуте хроматографирования. При этом на хроматограммах, детектируемых по поглощению на разных длинах волн в этом временном диапазоне, этот продукт или несколько продуктов детектируются на уровне шумов (см. рис. 9Б и В — 1).

Таким образом, анализ флуоресцентных свойств отдельных компонентов в хлороформном экстракте РПЭ при ВЭЖХ-анализе показал, что наибольший относительный вклад в суммарную флуоресценцию вносят флуорофоры группы А2Еох,deg. Скорее всего, эти компоненты являются продуктами фотоокисления и фотодеградации А2Е и ПТР-димера.

т4

При сопоставлении хроматограммы ВЭЖХ-анализа фотоокисленного А2Е (см. рис. 8Б) с аналогичными данными ВЭЖХ-анализа хлороформного экстракта РПЭ (см. рис. 9Б) можно отметить аналогию в детектируемых продуктах групп А2Еоx,deg и A2Emod. Другими словами, можно сказать, что все вновь появляющиеся после облучения видимым светом А2Е продукты являются продуктами фотоокисления, фотодеградации и, возможно, модификации А2Е (например ПТР-димер). Мы не можем обсуждать количественные характеристики и истинные спектральные свойства этих продуктов, так как для большинства из них не известны коэффициенты экстинкции. Также мы не можем описать истинный вклад каждого компонента в суммарную флуоресценцию всей смеси, так как флуоресцентные свойства молекул зависят от их микроокружения. Экстрагируя флуорофоры из РПЭ, мы тем самым нарушаем это микроокружение. Вполне возможно, что флуоресцентные свойства отдельных флуорофоров ЛГ могут существенно меняться при их экстрагировании в хлороформ, а далее и при разделении на хроматографической колонке. Несмотря на то что по количественным характеристикам А2Е и является доминирующим соединением, его вклад как флуорофора в суммарную флуореценцию хлороформного экстракта (in vitro) незначителен. He исключено, что вклад А2Е в картину аутофлуоресценции глазного дна in vivo также может быть менее существенным, чем это считается в настоящее время.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также