Кинетические исследования гидролиза ОБМ и EPeFRET (ОБМ81-10З)

Декабрь 4, 2015 / Комментарии 0

Для определения кинетических констант гидролиза ОБМ специфичными иммуноглобулинами высокоочигценные антитела (IgG ОБМ+ фракция) инкубировали с ОБМ, а затем аликвоты реакционной смеси наносили на обращенно-фазовую колонку С4для определения степени гидролиза субстрата. На основе полученных данных была построена полная кинетическая кривая, а соответствующие кинетические константы определены из графика в координатах Уокера-Шмидта (рис. 9). Каталитическая эффективность kкат/Кm составила 1.1*103 и 3.0*103 М-1*с-1 в случае антител человека и мыши, соответственно (табл. 6). Данные величины более чем на два порядка ниже по сравнению с специфичными протеазами, например, энтерокиназой быка, эффективность которой по отношению к природному субстрату трипсиногену составляет 7.1-10в5 М-1*с1. В то же время, каталитическая эффективность изучаемых антител в большинстве случаев превосходит значения, продемонстрированные для ранее полученных абзимов. Можно предположить, что достаточно медленное, но направленное действие антител по протеолизу ОБМ, возможно, играет определенную роль в разрушении миелиновых структур и патогенезе PC.

р9

Кинетические константы гидролиза EPeFRET аутоантителами, трипсином и металлопротеазой матрикса — 3, а также ингибирование данной реакции слитными белками и препаратом Копаксон, известным лекарственным средством при PC, представляющем собой сополимер лизина, глутаминовой кислоты, аланина и тирозина, представлены в табл. 7 и на рис. 10. Каталитическая эффективность изученных биокатализаторов уменьшалась примерно на порядок в ряду трипсин — ММР-3 — абзим. Интересно, что значение kкат/Кm реакции гидролиза полноразмерного белка и модельного субстрата EPeFRET в случае каталитических антител оказалось близким и различается в пределах ошибки. Характер ингибирования расщепления EPeFRET слитными белками тиоредоксина с фрагментом ОБМ 81-103, его мутантом R97A, белком-носителем и Копаксоном радикально отличается в случае катализа абзимами и модельными протеазами. Если для каталитических антител способность к ингибированию в ряду Тrх-ОБМ81-103, Trx-OBM81-103(R97A). Тrх падает со значения IС50 7.0*10в-3 до 100 мкМ, то для ферментов рассчитанные значения 1C находятся в диапазоне от 3 до 20 мкМ независимо от типа ингибитора. Эффективное ингибирующее действие Копаксона на реакцию, катализируемую трипсином, по-видимому, объясняется высоким (до 29%) содержанием остатков лизина в этом сополимере.

р10

С использованием тех же групп пациентов и здоровых доноров была проанализирована связывающая активность к ОБМ и к его эпитопной библиотеке поликлонального пула иммуноглобулинов из сыворотки крови. Уровни аутоантител к фрагментам ОБМ 48-70 и 85-170, а также к полноразмерным молекулам ОБМ и МОГ были достоверно выше в сыворотке крови пациентов с PC в сравнении со здоровыми донорами. Однако специфическое взаимодействие всего лишь с двумя короткими фрагментами ОБМ 43-68 и 146-170 достоверно различалось в паттерне связывания аутоантител при PC и других нейродегенеративных заболеваний (рис. 11). Данный факт еще раз свидетельствует о необходимости тонкого дифференциального подхода к диагностике PC по уровню антител и мимикрирующих под него нейродегенеративных заболеваний неаутоиммунной природы. Противоречивые данные относительно корреляции уровня антител к ОБМ и развития PC могут быть связаны именно с использованием полноразмерной молекулы ОБМ в качестве тестового антигена. Интересно, что корреляция уровня антител с EDSS (качественный параметр, характеризующий тяжесть заболевания) была установлена для несколько других фрагментов основного белка миелина 81-103 (r2=0.332; р=0.024), 130-156 (r2=0.381; р=0.011), 146-170 (r2=0.310; р=0.033) (рис. 12), что свидетельствует о разной значимости пептидов ОБМ в инициации и развитии заболевания.

р11 р12

Как уже упоминалось, в последнее десятилетие роль В-клеточного ответа и сопутствующего образования антител к собственным антигенам при различных аутоиммунных заболеваниях приобретает все большее значение. Нами на основе имеющейся выборки пациентов с нейрональными патологиями показано, что каталитическая активность аутоантител по отношению к ОБМ и его фрагментам выделяет PC в сравнении с другими нейродегенеративными заболеваниями значительно больше, чем их связывание с данным антигеном. Продемонстрированная сайт-специфичность каталитических антител в отношении ОБМ и его презентированных пептидов позволяет вплотную подойти к созданию тест-систем для диагностики и терапии PC на основе сконструированных модельных субстратов.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также