Изучение амилоидогенеза in vitro: значение для разработки диагностики и терапии амилоидозов

Декабрь 6, 2015 / Комментарии 0

Амилоидозы (конформационные болезни) характеризуются неограниченно растущими белковыми отложениями в виде нерастворимых фибрилл (амилоидов) в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков. Накопление амилоидных отложений нарушает структуру и функцию органов и тканей, приводя к летальному исходу. Амилоиды играют центральную роль в патогенезе болезней, от которых страдают миллионы пациентов (болезнь Альцгеймера, Паркинсона, синдром Дауна, второй тип диабета, прионные болезни, системные амилоидозы и другие). Амилоидозы — главная причина смерти после сердечно-сосудистых и раковых заболеваний, причем их диагностика чаще всего посмертная. Наследственные амилоидозы составляют небольшой процент, а основной — спорадические его формы. Амилоидные отложения обнаруживаются в сосудах, в сердечной и скелетной мускулатуре при кардиомиопатиях, миокардитах, миозитах, включая и амилоидную кардиомиопатию. Молекулярные механизмы амилоидозов до конца не выяснены. Их выяснение необходимо для предупреждения амилоидозов, их ранней диагностики и назначения своевременного, эффективного лечения. Используются разные подходы для решения этих задач, и в том числе экспериментальное моделирование, включая и изучение амилоидогенеза in vitro в системах разных белков.

Известно более 30 белков, образующих амилоидные фибриллы, таких как т-белок, хантингтин, амилин, Аβ-пептиды, α-синуклеин, инсулин, лизоцим, миоглобин, транстиретин и др. Несмотря на различия в белках-предшественниках амилоидов, образуемые ими амилоидные фибриллы имеют общие свойства: β-складчатую структуру с отдельными β-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями Конго красным и тиофлавином T. Белки-предшественники амилоидов, не имеющие β-складчатой структуры, должны претерпевать трансформацию типа «α-спираль — β-складчатость», необходимую для образования амилоидных фибрилл, что, как правило, требует жестких условий, несовместимых с условиями in vivo (низкие значения pH, высокие температуры, длительная инкубация, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке, и другие). К сожалению, процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка in vivo и ее патологического проявления при болезнях, изучены недостаточно. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление природы белков в составе депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Успешное решение этих задач во многом зависит от фундаментальных знаний амилоидогенеза. Одним из эффективных подходов к решению этих задач наряду с другими подходами является изучение амилоидогенеза в системах in vitro: выяснение общих свойств амилоидов, образуемых разными белками, и их различий, открытие факторов, регулирующих их образование и разрушение, их влияния на жизнедеятельность клеток и т.д.

р1

Нами были открыты четыре новых амилоидных белка — цитоскелетные мышечные белки семейства тайтина. Мы провели in vitro исследования способности этих белков формировать амилоидные агрегаты в сравнении с Аβ-пептидами мозга. Эти белки (тайтин, X-, C-, Н-белки), связанные в саркомере с миозиновыми нитями, играют важную роль в формировании структуры саркомеров, механизме сокращения, его регуляции и в процессах сигнализации. Поскольку, как отмечено выше, разные белки-предшественники амилоидов имеют сходные свойства, то возможны и сходные подходы к разрушению их амилоидов. Разработка таких подходов на системах белков семейства тайтина имеет свои преимущества: значительные количества этих белков для экспериментов (они занимают третье место по количеству в саркомере после миозина и актина), высокое (-90%) исходное содержание β-складчатости в структуре их молекул, необходимой для формирования амилоидных фибрилл, а значит и высокая скорость формирования амилоидов этими белками. Все это подтвердили наши исследования. С помощью электронной микроскопии (ЭМ) было показано, что исследуемые нами белки X-, С- и Н, как и другие известные амилоидные белки, способны формировать разные амилоидные агрегаты: аморфные агрегаты, протофибриллы, спирально скрученные ленты, линейные фибриллы и их пучки (рис. 1, см. рис. 3, 6, 7). При электронно-микроскопическом сравнении амилоидных фибрилл Х-белка с амилоидными фибриллами Аβ-пептидов было обнаружено их структурное сходство (см. рис. 1). АР(25-35)-пептид и Аβ(1-42)-пептид образуют, подобно Х-белку (см. рис. 7В), спирально скрученные ленты длиной в несколько микрон и диаметром 25-27 нм с вариабельным осевым периодом 170-250 нм (см. рис. 7А, Б). Обнаруженное сходство позволило высказать предположение о возможности сходных подходов к разрушению амилоидов Х-белка и Ар-пептидов. Амилоидная природа наблюдаемых агрегатов белков семейства тайтина скелетных и сердечных мышц была подтверждена не только электронной микроскопией, но и поляризационной и люминесцентной микроскопией и спектральными методами с использованием специфических красителей Конго красного (KK) и тиофлавина T (TT). Основным методом выявления амилоидной природы фибрилл, образуемых разными белками, является их способность специфически взаимодействовать с этими красителями. Они используются и для исследования амилоидогенеза разных белков in vitro, и в клинической практике для определения амилоидных отложений in vivo. При окрашивании KK амилоидных структур, формируемых исследуемыми белками, мы наблюдали двойное лучепреломление в поляризационном микроскопе, а при окрашивании их TT — желто-зеленую флуоресценцию в люминесцентном микроскопе. При спектральных исследованиях интенсивность флуоресценции TT в присутствии амилоидных фибрилл X-, H- и С-белков и тайтина возрастала в ~10, ~9, ~7 и ~5 раз соответственно по сравнению с интенсивностью флуоресценции красителя в присутствии этих белков в молекулярной форме. При измерении спектральных характеристик раствора KK в присутствии фибрилл тайтина, X-, С- и Н-белков наблюдался сдвиг спектра поглощения красителя в длинноволновую область от -490 нм к -500 нм, что также характеризует специфичность связывания амилоидных фибрилл с KK.

В связи с тем, что амилоидные отложения находят в кровеносных сосудах, мы продолжили исследования, направленные на поиск новых амилоидных белков в мышцах, и в частности изучили амилоидные свойства гладкомышечного белка смитина (аналога тайтина скелетных и сердечной мышц). Поскольку смитин имеет молекулярную структуру подобную тайтину скелетных и сердечной мышц, мы предположили, что смитин также может легко формировать амилоиды.

С помощью ЭМ было показано, что смитин способен формировать аморфные агрегаты, а также пучки линейных фибрилл длиной ~0,5 мкм и более, шириной до 100 нм (рис. 2), как и другие известные амилоидогенные белки, в том числе и мышечные белки семейства тайтина.

На рис. 3 приведены пучки линейных амилоидных фибрилл, образуемых Аβ(1-42)-пептидом мозга и тайтином. На электронных микрофотографиях видно, что тайтин и Аβ(1 -42)-пептид формируют сходные по структуре пучки амилоидных фибрилл, подобные смитину (рис. 2Б).

р2

При спектральных исследованиях интенсивность флуоресценции тиофлавина T в присутствии аморфных агрегатов смитина возрастала в ~2 раза (рис. 4А), а в присутствии пучков смитина в ~10 раз (рис. 4Б) по сравнению с интенсивностью флуоресценции красителя в присутствии этого белка в молекулярной форме.

При измерении спектральных характеристик раствора KK в присутствии аморфных агрегатов и пучков фибрилл смитина наблюдался сдвиг спектра поглощения красителя в длинноволновую область от ~490 нм к ~500 нм (рис. 5), что также является характерной чертой при связывании KK с амилоидами.

р3

Проведенные исследования указывают на специфичность связывания красителей с агрегатами смитина, подтверждая их амилоидную природу.

Нами было показано, что смитин образует амилоиды in vitro и, как открытые нами ранее амилоидные белки семейства тайтина, может быть потенциальным участником развития амилоидозов in vivo.

Процессы формирования амилоидных фибрилл разными белками in vitro характеризуются разной скоростью. Она зависит от состава растворов, температуры, pH, ионной силы и др. Однако наибольшее влияние оказывает, скорее всего, тип вторичной структуры белка. Если белок содержит высокий процент а-спирали, то требуется трансформация типа «α-спираль — β-складчатость». При этом in vitro приходится использовать условия, несовместимые с условиями in vivo (денатурирующие вещества, низкие значения pH, высокие температуры, длительная инкубация, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.). Эти условия приводят к образованию β-складчатости, характерной для амилоидных фибрилл. Согласно литературным и нашим данным, молекулы белков семейства тайтина уже содержат 90% β-складчатой структуры, и для них нет необходимости в изменении вторичной структуры, вследствие чего они должны быстро формировать амилоиды in vitro. Образование ими амилоидных фибрилл происходит в мягких условиях (pH 7,0, температура 5-30°С, ионная сила, близкая к физиологической) и быстрее, чем в случае других амилоидных белков. Это преимущество и было продемонстрировано нами на примере Х-белка, так как он образует наиболее упорядоченные амилоидные фибриллы (спирально скрученные ленты) и методом электронной микроскопии можно визуально оценить, как происходит процесс фибриллообразования. Параллельно в этих экспериментах динамика образования амилоидных фибрилл Х-белком оценивалась по их связыванию с флуоресцентным красителем TT, то есть по увеличению интенсивности флуоресценции красителя при спектрофлуорометрических измерениях (рис. 6). В образцах белка происходило накопление амилоидных фибрилл. He происходило значительного возрастания интенсивности флуоресценции TT в первые часы инкубации (1—4 часа), так как фибриллы еще не были сформированы, а присутствовали только аморфные агрегаты (см. рис. 6А). При дальнейшей инкубации интенсивность флуоресценции TT возрастала, что соответствовало образованию амилоидных протофибрилл (см. рис. 6Б), среди которых наблюдались и аморфные агрегаты. После 22 часов интенсивность флуоресценции красителя при связывании со зрелыми фибриллами достигала плато, что согласуется с данными электронной микроскопии, демонстрирующей присутствие хорошо сформированных спирально скрученных ленточных фибрилл Х-белка (см. рис. 6В). Они наблюдаются и после 26 часов диализа.

р5

Накопление амилоидов в клетках и тканях организма может приводить к их гибели, и важно не допустить агрегацию и накопление амилоидов в организме. Поэтому наши дальнейшие исследования были направлены на поиск подходов к разрушению амилоидов и предотвращению их образования.

Для выяснения возможных подходов к разрушению амилоидных фибрилл, образуемых Х-белком семейства тайтина в сравнении с Аβ(1-42) и Аβ(25-35)-пептидами мозга, было проведено изучение эффекта тетрациклина и фуллерена C60 на структуру их фибриллярных агрегатов. Мышечный Х-белок является наиболее удобной моделью для этих экспериментов, благодаря способности строить упорядоченные спирально скрученные ленты, сходные с амилоидными фибриллами Ар-пептидов мозга (рис. 7А, Б).

р7

Нами показано, что антибиотик тетрациклин разрушает фибриллы, формируемые белками семейства тайтина. На снимках видны фрагменты фибрилл Х-белка после действия тетрациклина длиной ~24-64 нм (рис. 8Б) и отдельные молекулы Х-белка. Действие тетрациклина на фибриллы Х-белка подобно его действию на амилоиды Аβ-пептида и т-белка при болезни Альцгеймера, на депозиты хантингтина при болезни Хантингтона, а также на амилоидные фибриллы прионного белка.

р8

В последнее время фуллерены (рис. 9) рассматривают как лекарственные препараты, в том числе и для лечения нейродегенеративных болезней. Важность использования фуллерена C60 в этих исследованиях обусловлена наличием у него таких положительных свойств, как нейропротекция и сильные антиоксидантные свойства. Невизуальным методом показано ингибирующее влияние производного фуллерена C60 (1,2-(диметоксиметано)фуллерен) на фибриллогенез Аβ(11-25)-пептида и Аβ(1-40)-пептида in vitro.

Биологическое действие фуллеренов обуславливается прежде всего тем, что, несмотря на большое количество атомов, молекула фуллерена компактна. Диаметр молекулы C60 равен -0,71 нм (при молекулярной массе 720 дальтон), что сравнимо с размерами таких органических молекул, как бензол, фенилаланин и меньше размера более сложных молекул, таких как АМФ.

Однако серьезным осложняющим фактором при исследовании биологических свойств самого фуллерена и большинства его производных является их практически полная нерастворимость в полярных растворителях. Для решения этой проблемы используются следующие подходы: стабильные коллоидные растворы фуллеренов в воде, нековалентные комплексы фуллеренов с гидрофильными органическими молекулами, в том числе с полимерами, синтезированные водорастворимые производные фуллеренов.

Эти подходы имеют свои достоинства и недостатки. В коллоидных растворах фуллеренов, как и в некоторых нековалентных комплексах, молекулы фуллерена находятся в виде ассоциатов. Присоединение радикала к молекуле фуллерена приводит к изменению природы самого фуллеренового ядра, причем чем больше степень замещения, тем более выражено это изменение. Поэтому физические, химические и биологические свойства фуллеренов, а также их ковалентных производных могут принципиально различаться. Кроме того, введение объемных заместителей может стерически блокировать само фуллереновое ядро, что также скажется на его способности проявлять собственные биологические свойства.

Методом ЭМ мы впервые продемонстрировали антиамилоидогенную способность гидратированного фуллерена C60 (C60 HyFn) по отношению к фибриллам Аβ(25-35)-пептида, Аβ(1-42)-пептида и Х-белка. Добавление C60 HyFn к спирально скрученным лентам Х-белка в весовом соотношении 1:2 приводило к их декорации сферическими частицами фуллерена, уменьшению длины и ширины лент (данные не показаны). Более того, в присутствии C60 HyFn Х-белок в молекулярной форме не формировал амилоидных фибрилл. Добавление C60 HyFn к амилоидам Ар(25-35)-пептида в молярном отношении 15:6 и инкубация их в течение 24 часов при 37°С приводит к декорации его спирально скрученных лент сферическими частицами фуллерена, уменьшению их диаметра, длины и количества (рис. 10Д) по сравнению с контролем (рис. 10А, Б). Мы наблюдали аналогичный эффект C60 HyFn и на амилоиды Аβ(1-42)-пептида. Следует отметить, что тетрациклин и C60 HyFn не только разрушают амилоиды Х-белка и Аβ-пептидов, но и предотвращают их образование, что важно в терапии амилоидозов. Полученные результаты подтверждают наше предположение о возможности сходных подходов к разрушению амилоидов Х-белка семейства тайтина и Ар-пептидов мозга в связи с их общими структурными свойствами. Эти подходы могут быть предварительно разработаны на системах саркомерных белков семейства тайтина в силу их достаточных количеств и экономии финансовых затрат на исследования в сравнении с затратами на амилоидные пептиды. Нужно отметить и интенсификацию исследований вследствие уменьшения временных затрат на формирование амилоидов белками семейства тайтина. Следует также указать, что антиамилоидогенная активность фуллеренов, наноразмерных частиц, открывает перспективы для разработки новой медицинской нанотехнологии для терапии амилоидозов, и в частности для болезни Альцгеймера. Полученные нами данные показали, что введение в мозг крысам C60 HyFn положительно влияет на когнитивные процессы в норме. Этот результат свидетельствует об отсутствии нейротоксичности фуллерена C60. Более того, имеется соответствие между описанным выше антиамилоидогенным действием C60 HyFn на амилоиды Аβ(25-35)-пептида in vitro и его способностью предотвращать нарушение решения когнитивных вероятностных задач у экспериментальных животных, индуцированное Аβ (25-35)-пепидом. Эти данные позволяют рассматривать C60 HyFn как потенциальные лекарства при лечении амилоидозов. Однако этому препятствует его низкая растворимость в воде. В связи с этим нами были исследованы антиамилоидные свойства ряда водорастворимых производных фуллерена C60 (натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена C60 (C60Cl(C6H4CH2COONa)5), фуллеренолата натрия (NaFL), С60-аланина и нитроксипроизводных фуллерена C60 (C60-NO2-пролина, C60-(NO2)2-пролинa, C60-NO2-пролин-NO2), а также комплексов фуллерена C60 с поливинилпирролидоном (С60/ПВП) (м.м. ПВП 10000 и 25000).

р10

Методом ЭМ мы исследовали антиамилоидные свойства C60Cl(C6H4CH1COONa)5 (рис. 11 А). Данное производное фуллерена C60, в отличие от C60 HyFn, хорошо растворяется в полярных растворителях и не образует агрегаты in vitro.

Добавление C60Cl(C6H4CH2COONa)5 к спирально скрученным ленточным амилоидным фибриллам Х-белка приводило к их полному разрушению. Производное фуллерена C60Cl(C6H4CH2COONa)5 не только разрушало амилоидные фибриллы, но и предотвращало их образование. Аналогичный эффект это производное оказывало на амилоидные фибриллы Аβ(1-42)-пептпда мозга. В ходе ЭМ-исследования было показано, что данное производное фуллерена разрушало фибриллы Аβ(1-42)-пептида мозга и предотвращало образование новых фибрилл. Это важно, поскольку современная превентивная стратегия медицины направлена на предотвращение перехода мягких когнитивных нарушений и начальных форм болезни Альцгеймера в развитые формы этой болезни.

р11

Электронно-микроскопическое исследование антиамилоидного действия NaFL (C60 (Na4[C60(OH)-30])) (рис. 11В) на фибриллы Х-белка и Аβ(1-42)-пептида мозга показало, что он, так же как C60Cl(C6H4CH2COONa)5, разрушал зрелые фибриллы Аβ(1-42)-пептида мозга, а также предотвращал их образование (рис. 12В, Г). Аналогичный эффект NaFL оказывал на амилоиды Х-белка.

Антиамилоидный эффект на исследуемые фибриллы был выявлен у С60/ПВП (м.м. ПВП 10000 и 25000) (рис. 13) (Бобылёв и др. 2009). Следует отметить, что, по данным электронной микроскопии, С60/ПВП в солевом растворе образует сферические агрегаты (см. рис. 13А), подобные агрегатам C60HyFn. Однако, в отличие от них, агрегаты С60/ПВП имеют меньший диаметр (-5-30 нм) и количество этих агрегатов значительно меньше в поле зрения, чем у C60HyFn.

р12

Исследование антиамилоидных свойств С60-аланина (см. рис. 11Ж) и нитроксипроизводных фуллерена C60 (С60-NO2-пролин (см. рис. 11Г), C60-(NO2)2-прлин (см. рис. 11Д), C60-NO,-пролин-NO2 (см. рис. 11E)) показало, что С60-NO2-пролин-NO2 оказывал эффективное антиамилоидное действия на амилоидные фибриллы исследуемых белка и пептида. C60-NО2-пролин и C60-(NO1)2-пролин разрушали амилоиды не так эффективно, как C60-NO2-пролин-NO2, C60Cl(C6H4CH2COONa)5, NaFL и С60/ПВП. Согласно ЭМ-наблюдениям, добавление С60-аланина, С60-NO2-пролина и C60-(NO2)2-пролинa к амилоидным фибриллам Х-белка и Аβ(1-42)-пептида приводило к снижению их количества относительно контроля, а также к уменьшению их длины (рис. 14Б, Г). Зрелых фибрилл в данных образцах не наблюдалось. Также было обнаружено, что C60-NO2-пролин и C60-(NO2)2-пролин в солевом растворе образуют агрегаты диаметром до 100 нм и более. Из полученных нами ЭМ-данных следует, что большинство исследованных производных фуллерена C60 и его комплексов разрушают амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и Аβ(1-42)-пептида мозга. При этом действие одного и того же исследованного вещества на фибриллы белка и пептида сходно. Однако действие на амилоидные фибриллы исследуемого белка и пептида разных производных фуллерена C60, по данным электронной микроскопии, не одинаковое. NaFL разрушает амилоидные фибриллы Х-белка и Аβ(1-42)-пептида более эффективно (см. рис. 12), чем, например, C60-NO2-пролин (см. рис. 14) при одной и той же концентрации.

р13

Таким образом, электронная микроскопия — многообещающий метод тестирования эффективности лекарственных препаратов для терапии болезни Альцгеймера.

Следующей нашей задачей было изучить антиамилоидные свойства исследованных веществ с помощью флуоресцентного анализа.

Ряд авторов, изучающих антиамилоидные свойства разных веществ, используют флуоресцентный анализ, в основе которого лежит свойство TT взаимодействовать с амилоидными фибриллами. При этом взаимодействии происходит увеличение интенсивности флуоресценции красителя при спектрофлуориметрических измерениях. Было показано, что причиной возрастания интенсивности флуоресценции TT при его связывании с амилоидными фибриллами является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы красителя друг относительно друга в возбужденном состоянии. Благодаря таким уникальным флуоресцентным свойствам TT широко используют при изучении амилоидогенеза in vitro.

р14

При попытке исследовать антиамилоидный эффект C60 HyFn, С60/ПВП, C60-(NО2)2-пролин, C60-NO2-пролин и С60-аланин на фибриллы мышечного Х-белка и Аβ(142)-пептида мозга флуоресцентным методом мы обнаружили, что эти фуллерены способны поглощать свет в той же области, что и краситель TT, поэтому использование флуоресцентного анализа при оценке антиамилоидного эффекта для данных фуллеренов является невозможным. Для данных веществ электронная микроскопия использовалась как один из основных методов оценки их способности разрушать амилоидные фибриллы.

По данным флуоресцентного анализа натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена C60 разрушала амилоидные фибриллы Аβ(1-42)-пеитида и Х-белка (рис. 15Б, Д). Разрушение амилоидных фибрилл Аβ(1-42)-пептида и Х-белка этим производным приводило к значительному снижению интенсивности флуоресценции ТТ. Аβ(1-42)-пептид и Х-белок в присутствии C60Cl(C6H4CH2COONa)5, добавленной до формирования ими амилоидных фибрилл, после 24 ч инкубации не увеличивали интенсивность флуоресценции тиофлавина Т. Это также свидетельствует о способности C60Cl(C6H4CH1COONa)5 предотвращать образование амилоидных фибрилл. Аналогичные данные были получены для NaFL, C60-NO2-пролин-NO2 и С60-аланина (рис. 15А, Г и 15В, Е).

Таким образом, результаты, полученные с помощью флуоресцентного анализа, подтвердили электронно-микроскопические данные. ЭМ в комплексе с флуоресцентным анализом повышают объективность отбора наиболее эффективных антиамилоидных веществ.

р15

Мы показали, что фуллерен C60 и его водорастворимые производные разрушают амилоидные фибриллы мышечного Х-белка. Нам необходимо было проверить, как исследованные вещества действуют на другие фибриллярные структуры мышц. Так как фибриллы актина являются одним из структурных элементов саркомера сократительного аппарата мышц, мы исследовали способность фуллерена C60 и его производных влиять на формирование фибрилл актина и взаимодействовать с ними in vitro.

Мышечный актин занимает второе место по количеству в саркомере после миозина, составляя 22% от общего количества саркомерных белков. Кроме того, фибриллярный актин является одним из основных компонентов цитоскелета эукариотических клеток. Это обуславливает интерес изучения его взаимодействия с фуллереном C60. Актин является глобулярным белком с преобладанием в его в структуре α-спирали. Он способен формировать длинные нити. В мышечном саркомере их длина составляет -1 мкм. Однако сформированные in vitro нити актина могут достигать нескольких микрометров.

С помощью ЭМ мы исследовали способность С60/ПВП, NaFL, а также C60Cl(C6H4CH2COONa)5 разрушать нити актина, сформированные in vitro, или препятствовать их формированию.

При исследовании способности С60/ПВП (м.м. ПВП 10000 и 25000) и NaFL влиять на структуру нитей актина показано, что данные вещества не разрушали нити актина в течение 24 ч (рис. 16Б) (для NaFL данные не представлены). Показано также, что глобулярный актин в присутствии С60/ПВП и NaFL способен строить нити (рис. 16В). Эти результаты свидетельствуют о специфическом взаимодействии данных фуллеренов с амилоидными фибриллами Х-белка и Аβ(1-42)-пептида с последующим их разрушением, а не с фибриллами актина. Напротив, C60Cl(C6H4CH2COONa)5 разрушала нити актина, а также препятствовала их формированию (рис. 16Г, Д).

р16

Анализируя полученные ЭМ данные о влиянии исследованных производных фуллерена C60 на филаментообразование актина, можно заключить, что гидрофобные взаимодействия вносят основной вклад в способность фуллерена C60 связываться с патологическими для клетки амилоидными фибриллами и разрушать их, не нарушая структуры фибрилл актина. Однако результаты, полученные для C60Cl(C6H4CH2COONa)5, которая препятствовала формированию нитей актина и разрушала их, вызывают сомнения по поводу возможности ее применения на биологических объектах. Поэтому мы провели исследования токсичности использованных производных фуллерена C60 и его комплексов.

В качестве объекта исследования токсического действия фуллерена C60 и его производных была выбрана культура клеток карциномы гортани человека НЕр-2. Эта клеточная культура широко используется в качестве модели, так как она не требует сложных сред, обладает четким митотическим индексом и на вторые-третьи сутки образует монослой.

Мы показали, что С60/ПВП (м.м. ПВП 25000 и 10000) не оказывали токсического действия на культуру клеток НЕр-2 (рис. 17А). В этой культуре клеток наблюдалась их 100-процентная выживаемость при добавлении как комплексов С с поливинилпирролидоном, так и самого полимера ПВП с молекулярными массами 25000 и 10000 в диапазоне концентраций 0,016-2 мг/мл.

Исследование цитотоксичности NaFL, С60-аланина и C60-NO2-пролипа показало ее отсутствие на НЕр-2 культуру клеток в диапозоне концентраций 0,016-2мг/мл для С60-аланина (рис. 17В) и NaFL, а также 0,001-0,2 мг/мл для C60-NO2-пролина (рис. 17Б).

р17

C60Cl(C6H4CH2COONa)5 оказывала выраженное токсическое действие на исследуемую культуру клеток в диапазоне концентраций 0,016-2 мг/мл (рис. 17Г), что наряду с данными по разрушающему действию на мышечный актин исключает ее из списка потенциальных антиамилоидных веществ.

Нам не удалось исследовать токсичность C60-(NO2)2-пролина и С60-NO2-пролин-NO2 на клеточной культуре. Это связано с их способностью образовывать крупные (до 200 нм и более) нерастворимые агрегаты (данные электронной микроскопии).

Анализируя имеющиеся экспериментальные данные, мы выделили наиболее эффективные и нетоксичные антиамилоидные вещества среди исследованных производных фуллерена C60. В таблице представлены основные свойства, на наш взгляд, определяющие эффективность изучаемых веществ. Среди них основными являются антиамилоидный эффект, оказываемый фуллереном или его производными на амилоиды Х-белка и Аβ(1-42)-пептида, а также токсические свойства фуллеренов.

т1 т1.1

Из таблицы следует, что фуллеренолат натрия является наиболее эффективным и нетоксичным антиамилоидным веществом. Он не образует агрегатов, способен разрушать амилоиды и предотвращать их образование, нетоксичен, и его антиамилоидный эффект можно регистрировать по интенсивности флуоресценции ТТ. Также в группу наиболее эффективных и нетоксичных антиамилоидных веществ можно отнести комплексы фуллерена C60 с ПВП, поскольку наряду с сильными антиамилоидными свойствами, низкой агрегационной способностью, у этих комплексов отсутствует токсичность. Мы также показали, что С60/ПВП (м.м. ПВП 10000 и 25000) и фуллеренолат натрия не препятствуют филаментообразованию актина и не разрушают его нити in vitro.

Среди всех исследованных производных фуллерена C60 были отобраны фуллеренолат натрия и комплексы фуллерена C60 с ПВП как наиболее эффективные и нетоксичные антиамилоидные вещества, на основе которых могут быть созданы антиамилоидные препараты.

Таким образом, наши комплексные методические подходы, с одной стороны, дающие оценку антиамилоидных свойств разных препаратов как визуальным так и спектральным методами, а с другой — оценку цитотоксичности исследуемых антиамилоидных веществ, позволяют осуществлять подбор наиболее ценных и нетоксичных лекарственных средств для борьбы с разными амилоидами и амилоидозами. Эти подходы могут быть отработаны на системах саркомерных белков семейства тайтина, благодаря их свойствам, благоприятствующим проведению эффективных исследований.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также