Исследование субстратной специфичности анти-ОБМ аутоантител на модельных пептидах

Декабрь 4, 2015 / Комментарии 0

Дальнейшее исследование специфичности аутоантител мы проводили с помощью сконструированной «эпитопной библиотеки» перекрывающихся пептидов в составе слитных белков с тиоредоксином, соответствующей полной последовательности ОБМ. Этот подход был выбран на основании концепции предпочтительного «представления» субстратных пептидов в растворе. Доступность соответствующего эпитопа в качестве потенциального субстрата аутоантител требует придания этому пептидному фрагменту определенной структуры в растворе, что может быть обеспечено лишь в составе биополимера. Для изучения протеолиза отдельных эпитопов ОБМ специфичными антителами были созданы двенадцать генноинженерных конструкций, содержащих последовательности, кодирующие различные фрагменты ОБМ (рис. 4), на основе экспрессионного вектора рЕТ-32b-СН(+). Между тиоредоксином и последовательностью пептидов ОБМ был помещен линкер (SGGGG)3S. Подобный серин-глициновый линкер используется в большом количестве работ для придания гибкости и подвижности конструируемым рекомбинантным белкам. Наличие подобного пептидного линкера содействует корректной презентации фрагментов ОБМ в составе фьюжн-белка с тиоредоксином.

Для характеристики субстратной специфичности антител фьюжн-белки тиоредоксина с фрагментами ОБМ инкубировали с иммуноглобулинами (суммарная IgG фракция), выделенными из сыворотки крови 26 больных PC, 22 пациентов с другими нейродегенеративными заболеваниями (other neurological diseases, OND), 11 здоровых доноров (healthy donors, HD) и мышей аутоиммунной линии SJL с ЭАЭ, индуцированным иммунизацией ОБМ. Как видно из приведенных электрофореграмм (рис. 5), в случае пациентов с PC и остеохондрозом (OND) протеолизу подвергались только пептиды, содержащие энцефалитогенную последовательность ОБМ. С другой стороны, у мышей SJL с ЭАЭ, предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, наблюдался множественный гидролиз перекрывающихся эпитопов ОБМ.

р5

Каталитические свойства проявили антитела, изолированные из сывороток крови 77% пациентов с прогрессирующим и 85% с ремитирующим типом течения PC. Среди больных нейродегенеративными заболеваниями и здоровых доноров доля положительного каталитического ответа была 9% и 0% соответственно (рис 6). Исключение составили два случая остеохондроза, при которых было отмечено наличие каталитической деградации пептида ОБМ под действием аутоантител. Причем эти больные характеризовались значительной длительностью патологического процесса и серьезными нейрональными поражениями. Расщепление рекомбинантных белков бычьим трипсином, катепсином D и металлопротеазой матрикса 3 (ММР-3) (см. рис. 5, нижняя часть) проводили как контроль на специфичность гидролиза. Для всех исследованных антител методом масспектрометрии SELDI сайты гидролиза были локализованы исключительно в рекомбинантных фрагментах ОБМ (рис. 7, табл. 4), белок-носитель и линкерная часть оставались интактными. Причем, в случае абзимов, выделенных из сыворотки крови мышей линии SJL, сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов повторяют таковые в нативном белке (см. рис. 7). При детальном анализе продуктов расщепления энцефалитогенного пептида антителами было обнаружено, что сайтами гидролиза являются как Lys91 так и Arg97, причем лишь у двух пациентов степень расщепления по двум приведенным сайтам оказалась сравнимой (см. табл. 4). В большинстве случаев при PC наиболее предпочтительным для гидролиза являлся аргининовый сайт. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что каталитические антитела, специфичные к участку ОБМ81103, составляют подавляющее большинство в общем пуле ОБМ-гидролизующих иммуноглобулинов при PC. Полученные данные находятся в соответствии с сообщениями относительно В-клеток, полученных от больных PC, узнающих преимущественно данный эпитоп, а также хорошо согласуются с фактом значительной иммунодоминантности этого фрагмента при представлении молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса патогенных Т-клеток. В случае мышей линии SJL, предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, репертуар протеолитических IgG, специфичных к ОБМ, намного шире и включает в себя антитела практически на все исследованные пептиды (см. рис. 5). Сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов данными антителами (см. рис. 7) в целом аналогичны действию на них неспецифической протеазы, однако по сравнению с ограниченным трипсинолизом не распространяются на тиоредоксин и линкерную часть. Объяснением возникновения такого разнообразия ОБМ-специфичных протеолитических антител у мышей линии SJL при иммунизации основным белком миелина может служить уже упоминавшаяся ранее особенность данной модельной линии — крайнее высокая частота индукции клонов В-клеток, продуцирующих каталитические антитела. Сравнение сайтов расщепления рекомбинантных субстратов из сконструированной нами библиотеки под действием аутоантител и набора протеиназ, в том числе специфичных к ОБМ (см. рис. 5, 7, табл. 4), приводит к выводу о достаточно значительных отличиях в специфичности этих биокатализаторов (процессинг полноразмерного белка аналогичными биокатализаторами представлен в табл. 5). Этот факт позволил нам поставить вопрос о «специфическом модельном субстрате» для возможного скринингового анализа сывороток больных PC и гибридом, продуцирующих моноклональные каталитические антитела к ОБМ.

р6 т5

На основании данных по «дифференциальной специфичности» по сравнению с расщеплением протеиназами для реакции с аутоантителами нами был выбран фрагмент 81—103, содержащий энцефалитогенную последовательность ОБМ, для интеграции во FRET-пapy. Для этого на основе вектopapQe30 была создана генно-инженерная конструкция, экспрессирующая два флуоресцентных белка PS-CFP2 и TurboYF, соединенные вышеуказанным пептидом ОБМ, так называемый «EPeFRET»-бeлoк (рис. 8А). При разрезании линкера прекращается резонансный перенос энергии и происходит падение флуоресценции (рис. 8Б,В).

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также