Исследование in vitro биосовместимости матриксов на основе гибридной золь-гель-полимерной системы, содержащей Zr, полученных методом двухфотонной фотополимеризации

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

Для исследования биосовместимости матриксов были выбраны материалы, полученные методом двухфотонной фотополимеризации на основе гибридной золь-гель-полимерной системы, содержащей цирконий. Скаффолд представлял собой квадрат со сторонами 2 мм, состоящий из цилиндров со следующими характеристиками: высота 110 мкм, внутренний диаметр 100 мкм, внешний диаметр 160 мкм. Клеточным материалом являлись первичные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18 дневных эмбрионов мышей линии C57BL/6.

Диссоциирование нервных клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа 0,25-процентным трипсином. Клетки ресуспендировали в нейробазальной среде NeurobasalTM (Invitrogen) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen), глутамином (Invitrogen), эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко). Диссоциированные клетки гиппокампа культивировали на матриксе, согласно разработанному протоколу, в течение 14 дней in vitro (DIV). Контролем служили диссоцированные клетки гиппокампа, культивируемые на стеклах в тех же условиях. Жизнеспособность культур поддерживалась в СО.-инкубаторе при температуре 35,5°С, в газовой смеси, содержащей 5% CO2. Структуру и динамику развития культур оценивали с помощью инвертированного микроскопа DM1000 (Leica, Германия).

Оценка биосовместимости осуществлялась по динамике роста диссоциированной культуры клеток гиппокампа в течение 14 дней развития in vitro и по параметрам морфо-функционального состояния сформировавшихся на матриксах нейрон-глиальных сетей, которые регистрировали с помощью метода функционального мультиклеточного нейроимиджинга с применением кальций-специфичного флуоресцентного маркера Oregon Green 488 ВАРТА-1 AM (OGB 1). Известно, что кратковременное увеличение концентрации Ca2+ в цитоплазме клетки является сигнальным процессом, запускающим различные каскады биохимических реакций. Ca2+-активность нервных клеток — это способность нейронов и глии быстро изменять содержание цитоплазматического Ca2+ в виде осцилляций. Спонтанная Са2+-активность в клетках формируется при активации ионотропных и метаботропных рецепторов, ионных каналов и регулируется работой белков — транспортеров. Таким образом, оценка изменения внутриклеточной концентрации ионов кальция выполняет роль надежного показателя функциональной активности нейронных сетей и свидетельствует о биосовместимости молекул полимерного матрикса и клеток нервной ткани. В работе был использован лазерный сканирующий конфокальный микроскоп LSM 510 (Carl Zeiss, Германия). Анализ Са2+-осцилляций, полученных при помощи флуоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с помощью оригинального программного пакета «Astroscanner». Анализировались записи функции F(t) зависимости средней интенсивности флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей с телом клетки) от времени. Для определения времени начала и конца осцилляции был взят порог отклонения от среднего значения в размере стандартной квадратичной ошибки F(t). Полученные данные отражали количество Са2+-осцилляций в минуту и их длительность.

В ходе анализа динамики роста диссоциированной культуры клеток гиппокампа в течение 14 дней развития in vitro с помощью инвертированного микроскопа DM1000 (Lieca, Германия) были выявлены основные закономерности развития, характерные для нормального формирования нейронных сетей первичных диссоциированных культур. В конце первых суток культивирования жизнеспособные клетки прикреплялись в большом количестве на матриксы. Начиная со второго дня культивирования наблюдалось образование на поверхности субстрата сложных сплетений растущих отростков нервных и глиальных клеток, интенсивные процессы роста нейронов и глии, соединение клеток между собой многочисленными отростками (рис. 12), подобно клеткам, которые культивировались на стеклах. Образованные нейронные сети культуры сохраняли жизнеспособность в течение месяца, что говорит об отсутствии токсического действия данного полимера на клетки мозга. На рис. 13 представлен кальциевый флуоресцентный имиджинг диссоциированной культуры гиппокампа эмбрионов мышей (Е18) на гибридных полимерных матриксах на 14-й день развития in vitro.

р12

Проведенные исследования функциональной активности нейронов показали появление спонтанных кальциевых осцилляций в диссоциированных культурах гиппокампа, выращенных на матриксах-носителях, на 14-й день культивирования in vitro, что свидетельствовало о формировании полноценной функциональной активности нейронной сети культивируемых клеток на гибридных полимерных матриксах (рис. 14).

р13

Длительность осцилляций составила от 5 до 12 с, частота — 0,9-2,0 (рис. 15) осцилляций в минуту. Наличие в диссоцированных культурах клеток гиппокампа спонтанных изменений содержания внутриклеточного кальция свидетельствовало о нормальном развитии культуры in vitro, соответствующем типичному для данного срока функционального онтогенеза (10-14 DIV).

С использованием лазерной флуоресцентной конфокальной микроскопии были построены 3D-изображения нейрон-глиальной сети, сформировавшейся на гибридных полимерных матриксах (рис. 16). Было доказано, что матриксы обладают хорошей адгезивной способностью, сохраняют прикрепившиеся при посадке нервные клетки, стимулируют рост их отростков.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также