Генетическое репрограммирование соматических клеток до плюрипотентного состояния

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

В 1981 г. двумя группами исследователей было показано, что клетки внутренней клеточной массы (BKM) можно изъять из бластоцисты мыши, и в специально подобранных условиях культивирования они способны длительное время пролиферировать in vitro, оставаясь при этом плюрипотентными, то есть способными к дифференцировке во все ткани организма, исключая трофобласт. Такие клетки назвали эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). ЭСК человека были впервые получены в 1998 г. Дж.А. Томсоном и коллегами из избыточных бластоцист, не востребованных в процессе применения вторичных репродуктивных технологий.

Важным свойством ЭСК мыши является то, что несмотря на длительное существование в культуре in vitro они могут полностью выполнить программу эмбрионального и онтогенетического развития при помещении их обратно в бластоцисту. В химерной мыши производные ЭСК могут присутствовать во всех тканях, включая клетки зародышевого пути. Таким образом, с ЭСК мыши можно проводить генетические манипуляции in vitro, а затем получать гетерозиготных или гомозиготных мутантных мышей. За открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток, то есть за изобретение метода нокаута генов, в 2007 г. М. Эвансу, О. Смитису и М. Капеччи (М. Evans, О. Smittis, М. Capetchi) была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине. Развитие технологий полногеномного анализа позволило достаточно точно охарактеризовать транскрипционный профиль генов, экспрессирующихся в различных специализированных клетках, в том числе и в ЭСК.

Целый ряд транскрипционных факторов оказался уникальным для плюрипотентного состояния и, скорее всего, определяли его. Экспериментально это было доказано К. Такахаши и С. Яманака, которые клонировали выбранные гены в ретровирусные векторы и инфицировали ими в различных комбинациях мышиные фибробласты. Были идентифицированы 4 гена транскрипционных факторов: Oct-4, Sox2, с-Мус и Klf4, которые переводят фибробласты в плюрипотентное состояние. Клетки, полученные таким образом, назвали индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК). Результаты этой работы были опубликованы в 2006 г., экспериментальный подход поразил многих ученых, работающих в данной области, как совершенно неожиданный, хотя предпосылки к успеху были — еще в 1987 г. Действительно, P.Л. Дэвис и соавторы показали, что трансгенная экспрессия единственного транскрипционного фактора MyoD может превратить фибробласты в клетки мышц. Получение ИПСК не требует разрушения эмбрионов, что снимает этические проблемы, связанные с применением плюрипотентных стволовых клеток в научных исследованиях и в будущем — в регенеративной медицине.

Уже через год после оригинальной публикации, в 2007 г., С. Яманака успешно получил ИПСК из фибробластов человека с использованием того же набора транскрипционных факторов Oct4, Sox2, с-Мус и Klf4. Независимой группой Дж.А. Томсона в этом же году были получены ИПСК человека с использованием иного набора транскрипционных факторов: Oct4, Sox2, Nanog и Lin28. Дальнейшие исследования продемонстрировали возможность получения ИПСК как от различных млекопитающих: крыс, макак-резусов, свиней, так и из различных типов соматических клеток: кератиноцитов, эндотелиальных клеток, нейрональных клеток, клеток печени и клеток желудка, терминально дифференцированных лимфоцитов. Эти исследования продемонстрировали универсальность процесса репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния с помощью введения в клетки генов транскрипционных факторов.

Целый ряд подходов был разработан для того, чтобы доставлять репрограммирующие факторы в соматические клетки. В первых работах по получению и характеристике ИПСК использовались преимущественно ретровирусные векторы, которые встраиваются в геном клетки-хозяина. Было показано, что ретровирусные трансгены перестают экспрессироваться к концу репрограммирования, это явление назвали замолканием трансгена, или сайленсингом. Группе С. Яманака впервые удалось репрограммировать соматические клетки до плюрипотентного состояния с помощью плазмид, не интегрирующихся в геном клетки-хозяина, однако эффективность такого репрограммирования оказалась крайне низкой. Были также продемонстрированы и другие методы репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния без интеграции экзогенной ДНК в геном клетки-хозяина: с использованием piggyBac транспозона, синтетической РНК, аденовирусных векторов, вируса Сендай, эписомных векторов, белков. Поскольку репрограммирование — это, в общем, низкоэффективный процесс, были проведены работы по поиску способов повышения эффективности репрограммирования. Были идентифицированы химические молекулы, которые повышают эффективность репрограммирования. Эти молекулы, как правило, оказывают влияние на эпигенетическую машину клетки и/или способны выполнять функцию некоторых репрограммирющих факторов. Дальнейшее развитие этого подхода позволило в 2013 г. репрограммировать мышиные фибробласты до плюрипотентного состояния с использованием одних только малых химических молекул. В опубликованной несколько месяцев назад работе Дж. Ханна и коллег было показано, что при ингибировании белка MBD3, который принимает участие в моделировании хроматина, клетки мыши могут быть репрограммированы почти со 100-процентной эффективностью.

Эквивалентность ИПСК и ЭСК — это сложный и не разрешенный на сегодняшний день вопрос. Генетические и эпигенетические отличия между ЭСК и ИПСК могут влиять на процесс дифференцировки, что может привести при дифференцировке к появлению клеток с профилями экспрессии генов и биологическими характеристиками, отличными от клеток, полученных из ЭСК. Тесты на способность к дифференцировке считают ключевыми в доказательстве плюрипотентности клеток. Для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток мыши в качестве основного теста на способность к дифференцировке обычно используется тест на формирование жизнеспособных химер. Недавно методом инъекции диплоидных ИПСК в тетраплоидную бластоцисту (тетраплоидная комплементация) была выращена мышь, организм которой полностью развился из ИПСК, что указывает на эквивалентность некоторых линий ИПСК по своей способности к дифференцировке эмбриональным стволовым клеткам. В случае клеток человека исследователям доступны только менее строгие тесты, такие как in vitro дифференцировки, формирование тератом при введении иммунодефицитным мышам и способность к образованию эмбриоидных телец. Способность к формированию тератом является необходимым и достаточным тестом для того, чтобы определять клетки человека как плюрипотентные.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также