Болезнь Альцгеймера и генетический скрининг новых мишеней для разработки терапевтических препаратов

Декабрь 7, 2015 / Комментарии 0

Болезнь Альцгеймера (БА) характеризуется прогрессирующим снижением когнитивных функций, в первую очередь памяти, а также развитием поведенческих расстройств. Это заболевание является наиболее частой причиной деменции в пожилом и старческом возрасте. Нейропатологические изменения в мозге больных БА проявляются в накоплении в цитоплазме нейронов нейрофибриллярных агрегатов тау-белка и экстраклеточных отложений амилоида в форме так называемых сенильных бляшек. Основным компонентом сенильных бляшек является пептид размером 40-42 аминокислоты, названный амилоидным пептидом β (Аβ). Aβ является продуктом протеолитического расщепления большого трансмембранного белка, получившего название Amyloid Precursor Protein (АРР). Функция APP до конца еще не известна, что во многом затрудняет понимание основ патологического процесса. В норме Aβ в наномолярных количествах обнаруживается в кровотоке и спинномозговой жидкости, однако при БА происходит его локальное накопление в мозге, ведущее к гибели нейронов. Согласно современным представлениям, накопление токсических интермедиатов амилоидных фибрилл в мозге является центральным звеном во всех нейропатологических процессах, включая дисфункцию синапсов, нейродегенерацию, гибель нейронов и развитие деменции. При этом значительная часть работ указывает, что такими интермедиатами могут являться растворимые олигомеры Aβ.

В протеолитический процессинг АРР, ведущий к образованию Аβ, вовлечены β-секретаза (трансмембранная гликозил-аспартил-протеаза), получившая название ВАСЕ, и γ-секретаза, представляющая собой сложный белковый комплекс, основным компонентом которого являются трансмембранные белки пресенилин 1 (PSN1) или пресенилин 2 (PSN2). Все известные на сегодняшний день семейные формы БА связаны с мутациями в генах АРР, PSN1, PSN2. В геноме Drosophila melanogaster содержатся ортологи генов пресенелина (Psn) и APP (App1).

Appl характеризуется высокой степенью гомологии с АРР, подвергается аналогичному протеолитическому расщеплению, но не содержит последовательности, необходимой для генерации Aβ. Выключение Appl не приводило к летальному эффекту, но вызывало значительное изменение поведенческих реакций, которые восстанавливались при экспрессии АРР, что говорит о функциональном консерватизме между Appl Drosophila и APP человека. Целый ряд исследований указывает на ключевую роль Appl в формировании и поддержании синапсов у Drosophila. Эксперименты по определению локализации Appl показали значительное обогащение Appl в растущих аксонах и синаптических структурах, а также участие Appl в образовании и дифференцировке синапсов в нейромышечных контактах личинок. Гиперэкспрессия как Appl, так и APP человека вызывала нарушение аксонного транспорта. При гиперэкспрессии APP человека в Drosophila melanogaster он также транспортировался в пресинаптический терминал нейронов и постсинаптические участки нейромышечных контактов.

При моделировании БА на Drosophila melanogaster наиболее часто используют прямую экспрессию последовательности Aβ в Drosophila. Так А. Финелли с коллегами были получены линии дрозофилы, в тканях нервной системы которых экспрессировались последовательности Аβ, кодирующие пептиды разной длины (соответственно Aβ1-40 и Aβ1-42). У мух, несущих в геноме последовательность более амилоидогенного Aβ1-42, были выявлены диффузные амилоидные отложения и гибель нейронов. Эти нейропатологические процессы сопровождались прогрессирующими с возрастом дефектами в поведении, а также сокращением продолжительности жизни. Иная картина наблюдалась у трансгенных мух, несущих последовательности менее амилоидогенного Aβ1-40: отсутствие накопления амилоида и гибели нейронов на фоне все тех же усиливающихся с возрастом нарушений поведения. Дальнейшие исследования показали, что Aβ1-42, в Drosophila накапливается на начальных стадиях внутриклеточно и только потом детектируются его экстраклеточные депозиты.

Для определения эффектов на синаптические функции эндогенно синтезируемого Aβ1-42 его последовательность была экспрессирована в моторных нейронах и мышечных клетках личинок Drosophila. Оказалось, что образование Aβ1-42 по-разному влияло на синаптические функции в зависимости от типа клеток. Так, в нейронах, по мнению авторов, Aβ1-42 главным образом был представлен в виде олигомеров, приводя к уменьшению амплитуды возбуждающих токов и не влияя на долговременную депрессию (ДВД), в то время как для мышечных клеток было характерно образование агрегатов большого размера, возможно фибрилл, и увеличение амплитуды возбуждающих токов и ДВД. Применение вортамина, специфического ингибитора PD киназы, снижало ДВД до нормального уровня. Ингибирование PI3 киназы также улучшало способность к запоминанию, уменьшало количество Aβ1-42 фибрилл в мозге мух, в то время как количество олигомеров уменьшалось незначительно.

В другой работе нарушение синаптических функций, вызванное образованием Aβ1-42,в нейромышечных контактах имаго, сопровождалось прогрессирующим с возрастом уменьшением пресинаптических и аксонных митохондрий, уменьшением их скорости перемещения по аксону Причем значительное уменьшение числа пресинаптических митохондрий предшествовало наблюдаемым изменениям в синаптической трансмиссии и ультрасктруктуре синапсов. Экспрессия последовательности Aβc мутацией Arctic (Aβarc) значительно усиливала наблюдаемые фенотипы.

Нарушение транспорта и распределения митохондрий, снижение уровня белков митохондрий, которое отмечается в мозге больных БА, предполагает, что разрушение функций митохондрий является одним из компонентов или механизмов патогенеза БА. Аномальное распределение митохондрий в мозге наблюдалось у мух с экспрессией последовательности Aβ1-42: они аккумулировались в нервных клетках, в то время как в аксонах и дендритах их число было редуцировано. Однако сегодня пока трудно сказать, является ли нарушение функций митохондрий ранним проявлением в патогенезе заболевания или это всего лишь последовательное звено в патогенезе БА.

У Drosophila представлены все компоненты белкового комплекса, ответственного за активность γ-секретазы, но β-секретаза Drosophila не разрезает APP в β-сайте, при этом APPL не содержит последовательности Ар, поэтому для полного протеолитического процессинга полноразмерного APP и повышенной секреции Aβ были созданы линии Drosophila, в фоторецепторных клетках глаза которых одновременно были экспрессированы APP и ВАСЕ человека и мутантные PS1, вызывающие семейные формы БА. В рамках этой модели удалось воспроизвести наиболее важные патологические признаки БА, а именно — образование амилоидных отложений и гибель нервных клеток.

В своей работе, выполненной в рамках программы РАН «Фундаментальные науки медицины», мы провели экспрессию APP и ВАСЕ человека в нервных клетках Drosophila. У мух развивалась прогрессирующая с возрастом нейродегенерация в мозге, нарушение способности к обучению и запоминанию, а также уменьшение плотности синаптических белков в грибовидном теле мозга Drosophila. Интересно, подобные нарушения наблюдались у мух с экспрессией полноразмерного APP или APP с мутацией Swedish, независимо от секреции Aβ. Следовательно, можно предположить, что мутантный APP или другие фрагменты его протеолиза могут иметь нейротоксичные свойства. Недавно было установлено, что неамилоидогенные фрагменты АРР, которые также обнаруживаются в амилоидных депозитах, как и Аβ-пептид, обладают способностью формировать ионные каналы, вызывая выброс кальция, разрушение нейритов и гибель нейронов. В этой связи следует отметить, что роль Aβ как основного фактора в патогенезе БА широко дискутируется в настоящее время.

Исходя из вышеперечисленных биологических особенностей и разработанных генетических методов на Drosophila часто и успешно проводят скрининг генов-модификаторов патологических процессов, что позволяет значительно ускорить проведение исследований и снизить затраты на них. Для скрининга генетических модификаторов амилоидоза были использованы линии мух, экспрессирующие Aβ42 в фоторецепторных клетках глаза. Экспрессия Aβ42 в глазах мух вызывала ярко выраженный фенотип, характеризующийся дезорганизацией фоторецепторных клеток и уменьшением размера глаз («rough eye»). Для скрининга была использована коллекция из 1963 линий дрозофилы, несущих в геноме вставки EP-транспозона. ЕР-транспозон является производным P-элемента, содержит промотор, активируемый GAL4, и в зависимости от сайта и ориентации инсерции модулирует активность генов. Все линии этой коллекции индивидуально скрещивались с мухами, экспрессирующими Ар. Целью скрининга был поиск линий, в которых наблюдалась модуляция токсического эффекта Аβ, маркером которого являлся «rough еуе» -фенотип. В результате скрининга фенотипов и последующего ДНК-анализа было выявлено 23 гена модификатора. Среди них — гены, участвующие в различных секреторных процессах, гомеостазе холестерина, а также регулирующие транскрипцию и ремоделирование хроматина. Анализ влияния модифицирующих мутаций на общий уровень Aβ и уровень растворимого Aβ показал, что восемь мутаций статистически достоверно изменяют общий уровень Аβ, при этом в 7 случаях изменения варьировали в пределах 20-30% и только в одной из линий, несущей инсерцию в регуляторной зоне гена неприлизина 2 (пер2), наблюдалось снижение общего уровня Aβ на 70%. Деградация Aβ неприлизином, являющимся одной из мажорных нейропептидаз мозга, была доказана также при исследовании мышей с нокаутом гена неприлизина. У этих мышей была резко снижена скорость деградации C14-Aβ по сравнению с мышами дикого типа. На основании этих экспериментов было выдвинуто предположение, что повышение экспрессии неприлизина может быть одной из стратегических задач в подавлении амилоидоза при болезни Альцгеймера. Однако хроническая гиперэкспрессия неприлизина человека в нервных клетках Drosophila наравне с уменьшением нейродегенерации и внутриклеточных депозитов Aβ42 сокращала продолжительность жизни мух, вызывала прогрессирующую с возрастом дегенерацию аксонов в мозге и уменьшение транскрипции, контролируемой CREB.

В настоящее время показано, что нормальные клеточные функции других белков, участвующих в патогенезе БA, — пресенилинов, не исчерпываются их участием в γ-секретазном комплексе и требуют дальнейшего изучения. Для понимания функций пресенилинов был проведен поиск генетических модификаторов, модулирующих фенотип в крыльях и груди Drosophila, обусловленный гиперэкспрессией пресенилина. Было выявлено 177 модификаторов, среди которых — белки, регулирующие гомеостаз кальция, ответ организма на стресс и упаковку белков, а также компоненты сигнальной трансдукции, апоптотические факторы и белки клеточного цикла. При этом 58 модификаторов взаимодействовали также с APP Наличие среди них белков, регулирующих гомеостаз кальция (Calmodulin, sarcoplasmic calciumbinding protein, Ryanodine receptor), указывает на связь между пресенелинами, APP и регуляцией кальция и предполагает, что она может играть важную роль в патогенезе БА.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также