Автоматизация анализа микроскопических изображений нейронов и их отростков

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

Одной из важнейших задач нейронаук является разработка экспериментальных моделей социально значимых нейродегенеративных заболеваний (НДЗ), в частности, связанных с гибелью дофаминергических (ДА-ергических) нейронов. Дегенерация последних у человека в нигростриатной системе мозга приводит к развитию БП, а в тубероинфундибулярной системе мозга — к гиперпролактинемии и бесплодию. Создаваемые модели предназначены для разработки новых технологий диагностики и лечения этих заболеваний. Разработка и исследование моделей связаны с проведением массовых скрининговых исследований изменений моторного поведения, уровня секреции пролактина гипофиза, метаболизма дофамина в нигростриатной и тубероинфудибулярной системах мозга и морфологических изменений ДА-ергических нейронов и их аксонов в этих системах.

Оценка соответствующих морфологических показателей является наиболее трудоемкой и дорогостоящей, поскольку в скриннинговом исследовании используется материал от сотен животных. Один высококвалифицированный специалист-морфолог, например, в состоянии осуществить одновременно обработку материала только от двух животных по следующей схеме: а) приготовление 200 замороженных срезов (5 часов) — 150 срезов черной субстанции среднего мозга, где располагаются тела нейронов, и около 50 срезов стриатума — места локализации их аксонов; б) иммуноцитохимическое выявление ДА-ергических тел нейронов и их аксонов по тирозингидроксилазе — ключевому ферменту синтеза дофамина, и приготовление препаратов (5 дней); в) анализ срезов в световом микроскопе, получение изображений тирозингидроксилаза-иммунореактивных нейронов и их аксонов и ввод этих изображений в ЭВМ, обведение вручную терминалей аксонов стриатума и тел нейронов черной субстанции и подсчет 5-6 тысяч нейронов у одного животного (14 дней). Помимо высокой трудоемкости работа требует больших материальных затрат, складывающихся из: зарплаты высококвалифицированного исследователя, амортизации дорогостоящего оборудования и покупки дорогостоящих импортных реактивов, особенно специфических антител, сывороток, китов и флуоресцентных маркеров.

Создание моделей могло бы осуществляться гораздо быстрее и было бы экономически эффективнее при снижении временных и материальных затрат на морфологические исследования. Последнее возможно с помощью автоматизации и оптимизации методов обработки и анализа экспериментальных данных.

Результаты морфологических исследований представляются в виде цифровых изображений. Разработка и применение современного математического аппарата для автоматизации извлечения из изображений информации, необходимой для принятия интеллектуальных решений, является одной из критически важных проблем информатики. Новые методы анализа изображений являются необходимой предпосылкой разработки прорывных стандартизированных информационных технологий для автоматического анализа широких классов биомедицинских изображений и создания поддерживающих эти технологии АПК.

Автоматизация анализа микроскопических изображений нейронов (МИН) и их отростков позволяет снизить материальные затраты на порядок, а временные затраты на два порядка.

В последние годы разработано большое количество коммерческих систем, предназначенных для обработки, анализа и распознавания информации, представленной в виде изображений, в том числе для автоматизированного анализа биомедицинских изображений, однако специализированных систем или модулей, которые могут быть использованы для выделения нейронов на микроскопических изображениях срезов головного мозга, не так много.

Ниже приведена краткая характеристика некоторых из них.

1) Алгоритм автоматизированного распознавания нейронов «ANRA-Automated Neuron Recognition Algorithm». Метод разработан для поиска местоположения нейронов на цифровых изображениях срезов мозга мыши, окрашенных по методу Ниссля. Для идентификации нейронов используются методы сегментации изображений и методы машинного обучения. Шаги алгоритма включают сегментацию на основе активных контуров (для поиска среди объектов на изображении потенциальных нейронов) и обучение искусственной нейронной сети с использованием результатов сегментации (для разделения «нейронов» и «не-нейронов»).

2) Метод автоматического подсчета клеток «АССМ: Automatic Cell Counting Method». Метод разработан для подсчета клеток на срезах головного мозга, окрашенных различными антителами и окрашенных по методу Ниссля. Изображения окрашенных срезов преобразуются в бинарные изображения с помощью метода пороговой обработки. Кластеры пикселей со значением 1, соответствующие телу клетки, выбираются на основе размера. Параметры алгоритма (диапазон интенсивности и размеры кластеров) подбираются в зависимости от использованного метода окрашивания препарата.

3) Набор программных модулей «Neuron Metrics». «Neuron Metrics» обеспечивает полуавтоматический количественный анализ двумерных изображений культивированных нейронов, окрашенных флуоресцентными маркерами. Предложенный подход основан на геометрических признаках и позволяет оценить число ветвей сложных древовидных структур с большим числом контактирующих между собой аксонов. Алгоритм вычисляет общую длину аксона, количество ветвей, индекс полярности (меру полярности нейрона) и другие важные параметры, позволяющие получить представление о размере и форме аксонов, что важно при оценке функционирования нейронов. Полученные числовые данные записываются в отдельный текстовый файл и могут быть использованы другими приложениями для дальнейшего анализа.

Помимо вышеперечисленных программных средств существуют и другие системы и библиотеки алгоритмов, которые могут быть использованы для автоматизации решения задач, возникающих при работе с микроскопическими изображениями окрашенных срезов мозга, но они, как правило, либо являются коммерческими и довольного дорогими, либо являются системами широкого назначения (например «The ImageJ» и «The extensible Imaging Platform») и требуют наличия у пользователя большого опыта и навыков в области обработки, анализа и распознавания изображений, а также знаний по разработке программного обеспечения.

Обнаружение и выделение нейронов на двухмерных микроскопических изображениях срезов мозга усложняется следующими факторами: а) помимо нейронов на МИН могут присутствовать объекты, которые нейронами не являются (частички грязи, погрешности окрашивания, складки ткани, кровеносные сосуды и другие артефакты); б) нейроны на МИН могут заметно отличаться друг от друга как по размеру, так и по форме; в) нейроны могут быть повреждены в процессе подготовки срезов, что влияет на их форму и как следствие — приводит к большому числу разнотипных клеток на срезе; г) нейроны могут «слипаться» или в толще среза накладываться друг на друга.

В целом приходится согласиться с тем, что понятие «нейрон как визуальный объект» четко не сформулировано, и отсутствует универсальный перечень контекстных, логических, геометрических, качественных и количественных условий и характеристик, позволяющих стандартизировать описание/определение этого визуального объекта.

Как правило, процесс обнаружения и выделения нейронов на гистологических микроскопических изображениях включает следующие основные этапы: предварительная обработка, сегментация и классификация. Необходимость в предварительной обработке МИН вызвана наличием шума, низким разрешением МИН и неоднородностью контраста, связанной с погрешностями при окрашивании срезов. Для улучшения качества МИН обычно используют стандартные операции обработки изображений — сглаживание, обратную свертку, морфологическую фильтрацию и некоторые другие.

В опубликованных работах, посвященных автоматическому или полуавтоматическому выделению нейронов на МИН, для сегментации, в основном, используются алгоритмы, основанные на пороговой обработке, морфологических операциях, модели Поттса, методе водоразделов или активных контурах. Последующая классификация проводится, например, с помощью байессовских процедур, анализа главных компонент или методов машинного обучения.

Важным этапом анализа МИН срезов мозга является морфологическая характеризация выделенных нейронов. В последние годы определен широкий спектр специфических морфологических параметров для эффективной математической характеризации морфологии нейронов, в том числе их ядер и отростков.

Разработанный авторами главы математический аппарат для анализа МИН основан на совместном использовании методов математической теории анализа изображений и математической теории распознавания образов, математической морфологии, дескриптивных алгебр изображений, теории информации и методов математической статистики. Разработанные методы позволяют эффективно находить и выделять информативные объекты на микроскопических изображениях срезов мозга при задании ограничений на форму, размер, топологию и характеристики гладкости границ объектов.

Теоретическим фундаментом для разработки методов анализа МИН являлся дескриптивный подход к анализу и пониманию изображений И.Б. Гуревича. В соответствии с его концепцией, математические методы представляются в виде специализированных алгоритмических схем. Такие схемы включают основные этапы извлечения информации из изображений: 1) предварительную обработку (улучшение качества изображений, удаление несущественных деталей и фрагментов, статистическую и логическую фильтрацию); 2) анализ изображений (обнаружение объектов и выделение их контуров, сегментацию, выбор и выделение признаков, описывающих состав и содержание изображения, поиск, выделение и построение отдельных объектов, отображающих специфику анализируемых изображений и др.); 3) построение описания объектов, представленных на анализируемых изображениях; 4) классификацию изображений и объектов, на них представленных; 5) распознавание.

Методы специализированы и экспериментально исследованы для решения задачи выделения контуров объектов и подсчета их морфофункциональных характеристик: 1) терминалей аксонов ДА-ергических нейронов в области стриатума; 2) тел ДА-ергических нейронов в области компактной части черной субстанции (КЧС); 3) тел ДА-ергических нейронов в области аркуатного ядра (АЯ).

Поставленные задачи содержательно заключаются в выделении контуров и подсчете морфофункциональных количественных характеристик тел (рис. 5а, б) и их отростков (рис. 5в, г) ДА-ергических нейронов в ЧС при моделировании БП и в АЯ при моделировании гиперпролактенемии (экспериментальные животные из опытной группы подвергались воздействию нейротоксина, а контрольные — NaCl). Проводились исследования на изображениях срезов головного мозга здоровых животных и животных с патологией (см. рис. 5)

р5

В качестве источника экспериментальных данных использованы цифровые микроскопические изображения ДА-ергических нейронов, волокон и терминалей аксонов срезов головного мозга от контрольных и опытных животных (разрешение 0,0117 мкм2/пиксел2). Изображения были получены в Лаборатории нервных и нейроэндокринных регуляций регуляций ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук».

Терминали аксонов ДА-ергических нейронов выявляются на серийных срезах стриатума толщиной 12 мкм. Тела ДА-ергических нейронов выявляются на серийных срезах толщиной 20 мкм, в областях КЧС и АЯ.

Терминали аксонов являются мелкими округлыми объектами с площадью от 0,6 мкм2 до 3 мкм2. Форма терминалей аксонов может быть овальной, округлой, вытянутой или неправильной. На представленных негативных тоновых изображениях уровень яркости терминалей аксонов меньше уровня яркости фона.

Существенной характеристикой модели БП является количество терминалей ДА-ергических аксонов, иннервирующих стриатум при использовании различных схем введения нейротоксина — МФТП (доза, количество инъекций, интервалы между инъекциями). Она позволяет оценить степень дегенерации нейронов под воздействием нейротоксина. Степень дегенерации определяется как разница между числом терминалей ДА-ергических аксонов в контроле и опыте. Предполагается также, что терминали ДА-ергические аксоны, сохранившиеся после воздействия нейротоксина и гибели части нейронов, должны обладать повышенной функциональной активностью, направленной на компенсацию возникшего при этом дефицита ДА. Одним из показателей повышенной общей функциональной активности клеток и их отростков, в частности нейронов и их аксонов, может являться увеличение их размера. Специфическим показателем функциональной активности ДА-ергических нейронов может служить увеличение содержания в них тирозингидроксилазы — основного фермента синтеза ДА.

ДА-ергические нейроны в КЧС (рис. 6а) представляют собой темные округлые клетки со светлым ядром. Форма тел ДА-ергических нейронов может быть достаточно произвольной, однако в большинстве случаев наблюдается выпуклость сомы, окружающей ядро. Средний диаметр тел ДА-ергических нейронов находится в диапазоне 20,4±0,5 мкм. Ядра имеют овальную форму: размер минимального диаметра 6,3±0,3 мкм, размер максимального диаметра 9,3±0,3 мкм. Относительный размер тела (сомы) и ядра сильно варьируется (может наблюдаться как очень тонкая оболочка вокруг ядра, так и относительно маленькое ядро по сравнению с площадью сомы). МИН содержат большое количество волокон вокруг клетки, что может маскировать ее, создавая интенсивный фон вокруг нейрона.

Помимо перечисленных в предыдущем разделе факторов, затрудняющих обработку МИН, следует иметь в виду, что: а) МИН содержат участки мозга с различным количественным распределением нейронов на единицу площади; б) микроскопические изображения различных срезов мозга от разных животных сильно различаются по контрасту и яркости.

Известно, что ДА-ергические нейроны в области КЧС являются ключевым звеном регуляции моторного поведения: прогрессирующая дегенерация этих нейронов приводит к развитию БП.

р6

ДА-ергические нейроны в области АЯ (рис. 6б) головного мозга экспериментальных животных визуально не отличаются от нейронов в области КЧС. Нейроны, расположенные на изображениях АЯ, могут не иметь видимых ядер. Линейные размеры нейронов, расположенных на срезах АЯ, такие же, как и в случае с КЧС. Среднее количество нейронов на срезах АЯ в несколько раз меньше, чем в КЧС. Соответственно расположены нейроны более разрозненно друг относительно друга, что практически исключает случаи их взаимного соприкосновения.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также