Анализ кинетики накопления 5-АЛК-индуцированного Пп IX в аутоидентичных клеточных культурах

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

Во время проведения операций по удалению глиальных опухолей (НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко) были замечены различия в накоплении протопорфирина IX в опухолях одной степени озлокачествления — мультиформной глиобластомы. Некоторые глиобластомы проявляли столь низкое накопление и, соответственно, уровень флуоресценции Пп IX, что она не визуализировалась во флуоресцентном режиме Blue 400 микроскопа OPMIPENTERO, при этом демонстрируя слабое накопление с помощью спектрального анализа. Глиобластома — это наиболее частая и наиболее агрессивная форма опухоли мозга, поэтому она должна «хорошо» накапливать Пп IX. Ho во время операции в одном образце соотношение маркеров было близко к показателям доброкачественных опухолей. Формально назовем образец с небольшим отношением интенсивностей флуоресценции и рассеянного лазерного излучения «первым» образцом, а с высоким — «вторым».

В связи с этим было решено более подробно изучить механизм накопления Пп IX в клетках. С этой целью был проведен ряд исследований на клеточных культурах соответствующих опухолей. Их целью являлась регистрация изменения концентрации Пп IX в клетках опухолей, показавших различия в накоплении маркера во время операции, с течением времени.

Содержание эндогенных флуорофоров (порфирины, ФАД, НАД Н, коллаген, эластин, триптофан) в тканях, а также количественные данные об их концентрации и изменении с течением времени дают важную информацию о состоянии клеток тканей. ФАД и НАД Н участвуют в обменных процессах клеток, поэтому изменение их флуоресценции непосредственно связано с изменениями в окислительно-восстановительных реакциях клеток. Максимум флуоресценции ФАД лежит в диапазоне 520-540 нм, а НАД Н — 440-470 нм. Также эндогенные флуорофоры применяются для медицинской диагностики, ярким примером является протопорфирин IX (Пп IX), который участвует в процессе биосинтеза гема. Таким образом, Пп IX — отличный маркер, помогающий определить опухоль и ее границы. Для увеличения количества Пп IX в клетках в организм вводится 5-АЛК (5-аминолевулиновая кислота), которая является естественным предшественником Пп IX в синтезе гема. Помимо перечисленных флуорофоров необходимо обратить внимание на другие метаболиты гема (копропорфирин и уропорфирин), которые содержатся в нервных тканях. Данные метаболиты имеют очень схожие с Пп IX спектры флуоресценции с пиками на 613 нм и 619 нм соответственно. При возбуждении флуоресценции Пп IX выгорает и образуются фотопродукты (Фп), спектр которых имеет максимумы на 622 и 677 нм. Спектры пор-фиринов характеризуются значительным перекрытием линий ввиду общности их природы, поэтому их сложно различить между собой. В связи с этим важен анализ кинетики спектральных данных.

Для получения спектральных данных по динамике (с течением времени) накопления Пп IX в клетках соответствующих опухолей использовался комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа CarlZeiss серии LSM 710. Для возбуждения флуоресценции был выбран лазер с λ=514 нм, для подавления лазерного излучения использовались специальные фильтры. Спектры измеряли в диапазоне 520-750 нм, с шагом 9,7 нм, с интервалом времени 10 минут, для последних проходов интервал времени составил 30-40 минут.

При обработке данных основной целью является определение количества компонент и их концентраций. Для этого был использован метод главных компонент (ГК). Так как целью настоящего исследования было определение реального содержания веществ в клетках опухоли, помимо анализа МГК была проведена линейная декомпозиция спектров с использованием априорной информации, с предположением, что экспериментальные спектры состоят лишь из спектров флуоресценции ФАД, уропорфирина и Пп IX. В соответствии с этим каждая ГК является линейной комбинацией спектров реальных компонент, поэтому ГК были разложены на составляющие с получением матрицы С(2х2), где строки соответствуют реальным компонентам, а столбцы — ГК.

Исследуемые объекты:

1. Для определения концентрации веществ в мг/мл были проведены измерения на Zeiss LSM 710 пяти стандартных образцов с различной концентрацией Пп IX (10в-2-10в-6 мг/мл).

2. В исследовании приняли участие двое пациентов с глиобластомами, у которых в процессе удаления были выявлены различия в уровне флуоресценции опухолевых тканей. Операции проводились в рамках клинических исследований эффективности интраоперационной диагностики с использованием 5-АЛК на базе НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко. 5-АЛК вводилась пациентам за два часа до начала операции. Операция проводилась с использованием видеофлуоресцентного режима Blue 400 (ZeissOpmiPentero) под спектроскопическим контролем (ЛЭСА-01-БИОСПЕК).

3. Клетки опухолей пациентов были культивированы в Институте биологии гена РАН. Полученные клеточные культуры были разморожены и помещены в питательную среду RPMI для дальнейшего роста. Для увеличения количества Пп IX в клетках была добавлена 5-АЛК с концентрацией 100 мг/мл и pH 7,4, что соответствует благоприятным условиям для жизнедеятельности клеток.

В результате анализа спектральных данных для культуры первого типа была получена кинетическая кривая, приведенная на рис. 1. Значительное изменение концентрации Пп IX наблюдается спустя примерно 60 минут с момента добавления 5-АЛК в образец.

р1

По спектральным данным второго типа можно наблюдать, что рост концентрации Пп IX происходит значительно быстрей, чем в первом образце, и значительное изменение концентрации Пп IX заметно спустя уже 30 минут с момента добавления 5-АЛК в образец (рис. 2).

р2

Рассматривая общий характер кривых изменения концентрации Пп IX для обоих типов клеточных культур, можно построить следующую зависимость (рис. 3). Изменение концентрации Пп IX для первого образца происходит в области левее точки А, тогда как для второго — охватывает и первую, и вторую области.

р3

Для первого и второго типа клеточных культур можно определить характерные времена, когда концентрация достигает определенных уровней, и оказывается, что отношение характерных времен для первого и второго типов примерно одинаково, в соответствии с чем была предложена математическая модель накопления в клетках Пп IX, учитывающая концентрацию основных ферментов, участвующих в биосинтезе гема.

С использованием этой модели была проведена экстраполяция кинетических кривых за границы диапазона измерений. Было показано, что максимум концентрации Пп IX в клеточной культуре первого типа был бы достигнут примерно спустя 12 часов после добавления 5-АЛК в образец. Следовательно, низкий уровень накопления Пп IX, наблюдавшийся интраоперационно, можно объяснить тем, что между вводом пациенту 5-АЛК и операцией прошло недостаточное количество времени для достижения максимума концентрации Пп IX.

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также