Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с параноидной шизофренией и ответом на типичные нейролептики

Шизофрения — комплексное полигенно-наследуемое расстройство психики и головного мозга, манифестирующее в результате взаимосочетания предрасполагающих факторов наследственности и среды (психогенных, социогенных, экзогенных) и проявляющееся дезорганизацией и диссоциацией психических функций с развитием спектра психотических симптомов в виде бреда и галлюцинаций, специфическими нарушениями мышления и постепенным формированием эмоционально-волевого и когнитивного дефицита. В 2001 г. Всемирная организация здравоохранения внесла шизофрению в список десяти ведущих причин инвалидности.

По данным ВОЗ, 45 млн человек во всем мире страдают шизофренией. Число новых случаев в год составляет 4,5 млн, при этом начало заболевания приходится, как правило, на молодой возраст, что нарушает общественную, профессиональную активность пациента, обусловливает значительное бремя на семью и общество. 70% больных, несмотря на адекватно проводимую поддерживающую терапию, страдают от рецидивов или резидуальных симптомов долгое время. Длительное течение болезни, склонность к рецидивированию и хронизации, относительная эффективность фармакотерапии усугубляет ситуацию. В результате лица, страдающие шизофренией, обнаруживают ту или иную степень социальной недостаточности, ограничение работоспособности или стойкую ее утрату.

Параноидная шизофрения относится к многофакторным заболеваниям, предрасположенность к которым обусловлена сочетанием в генотипе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон, реализующийся при взаимодействии с соответствующими факторами окружающей среды, и имеет чрезвычайно сложный этиопатогенез.

Несмотря на определенные успехи в изучении этиологии и патогенеза, а также в поиске эффективных средств фармакотерапии, шизофрения по-прежнему занимает лидирующую позицию в списке патологических состояний центральной нервной системы, приводящих к инвалидизации и социальной дезадаптации больных. Многочисленные молекулярно-генетические исследования показали, что развитие психических и нейродегенеративных заболеваний опосредовано межгенными и ген-средовыми взаимодействиями. Идентификация генов, которые участвуют в развитии нервной системы и формировании психики, а также факторов среды, которые модулируют экспрессию этих генов, является первым шагом в исследовании психических и неврологических заболеваний. К настоящему времени учеными из разных стран выявлено небольшое число генов, демонстрирующих более или менее доказанную связь с риском развития шизофрении. Однако поиск генов-кандидатов, вовлеченных в этиопатогенез этого заболевания, не завершен. Особый интерес представляют гены системы метаболизма моноаминов и системы нейротрофического фактора, поскольку недавно была показана их вовлеченность в развитие психических и нейродегенеративных заболеваний.

До недавнего времени изучение вклада наследственности в развитие психических заболеваний как мультифакториальных заболеваний выполнялось, в основном, в рамках ассоциативных исследований генов-кандидатов, в последние годы, благодаря быстрому совершенствованию технологий массового генотипирования, в мире получили распространение полногеномные ассоциативные исследования (GWAS). В ведущих мировых журналах опубликован целый ряд результатов GWAS, посвященных идентификации новых генетических маркеров, ответственных за наследственную предрасположенность к шизофрении. В настоящее время в результате проводимых полногеномных исследований (GWAS), изучающих вклад как однонуклеотидных замен (SNP), так и вариаций числа копий (CNV) в предрасположенность к развитию шизофрении, выявлены полиморфные маркеры и хромосомные области, сцепленные с шизофренией: lq21.1, 2р16.3, 2q32.1, 6р21.3-22.1, 15q11.2, 15ql3.1 и 15q13.3. Высокая распространенность и неуклонный рост заболеваемости ПШ (параноидная шизофрения) во всем мире определяют важное социально-экономическое и медицинское значение этой проблемы, необходимость исследования механизмов развития данного заболевания с целью разработки эффективных методов диагностики, профилактики и патогенетической терапии с учетом этнической принадлежности и генетических особенностей каждого больного.

Проблема повышения эффективности терапии мультифакториальных психических заболеваний является одной из наиболее актуальных в современной клинической психиатрии, поскольку в условиях применения значительного количества самых разнообразных препаратов выявляются выраженные индивидуальные различия терапевтического эффекта.

Действие лекарства обусловлено его взаимодействием с рецептором. Индивидуальная вариабельность реакции больного на психотропный препарат велика как в отношении общего фармакодинамического эффекта, так и в отношении терапевтической дозы, от нормальной и повышенной чувствительности до полной резистентности к одному и тому же препарату. Выявлены расовые, этнические, половые, географические различия чувствительности к психотропным препаратам. Более того, существует группа пациентов, у которых развиваются побочные эффекты, вызванные терапией психотропными препаратами, варьирующие от просто приносящих беспокойство до угрожающих их жизни. Нейролептики являются основными препаратами для лечения шизофрении, однако пациенты, получающие нейролептики по-разному отвечают на данные препараты. Биологические предикторы эффективности нейролептиков широко изучаются в мире, и особый упор делается на поиск генетических маркеров.

Таким образом, фармакогенетические подходы не только дают возможность идентифицировать биологические предикторы ответов на психотропные препараты, но и, что более важно, — возможность определять молекулярные субстраты эффективности психотропных препаратов.

Молекулярно-генетические работы, посвященные изучению параноидной шизофрении в России, немногочисленны и затрагивают, в основном, исследование полиморфизма генов нейромедиаторных систем.

В результате ранее проведенных исследований в лаборатории молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН, у больных параноидной шизофренией (ПШ) русских и татар из Республики Башкортостан (РБ) были выявлены генетические маркеры эффективности и риска развития побочных эффектов при приеме нейролептиков по полиморфным локусам rsl800497 гена DRD2 и rs4818, rs4680 гена COMT; кроме того, было установлено, что полиморфные варианты генов DRD2, SCL6A3, 5-НТТ, СОМТ, G72 являются факторами повышенного и пониженного риска развития параноидной шизофрении.

Полученные результаты свидетельствует об актуальности продолжения поиска фармакогенетических маркеров ответа на нейролептиков и генетических маркеров риска развития параноидной шизофрении в разных этнических группах из РБ.

Целью настоящего исследования явилось изучение полиморфных вариантов генов PRSS16, ZNF804A, G72, SLC18A1, АРВА2, CHRNA7, DISCI, NRG1, RELN, PLXNA2, RGS2, GRIN2B, ассоциированных с шизофренией по данным полногеномных исследований в популяциях русских и татар из Республики Башкортостан и 6 генов-кандидатов системы нейротрофического фактора (NTRK2, BDNF, NGF NTRK3), нейрексофилина 1 (NXPH1) и нейрексина 1 (NRXN1) у больных параноидной шизофренией и здоровых доноров, проживающих в РБ.

Учитывая неоднородность населения нашей республики в этническом отношении, в исследуемые выборки были включены представители двух наиболее распространенных популяций Башкортостана: русских и татар. Обследованный контингент представлен 608 больными с диагнозом параноидной шизофрении F.20.0xx, согласно международной классификации болезней МКБ-10 ПШ различной этнической принадлежности (274 русских, 334 татарина). Средний возраст больных составил 42,93±11,15 лет.

Исследуемые выборки тестированы по специальному протоколу, включающему такие данные, как пол, возраст, этническая принадлежность, возраст начала заболевания, отягощенность наследственного анамнеза по психическим заболеваниям. От каждого больного было получено подписанное информированное согласие. Данное исследование было одобрено локальным биоэтическим комитетом ИБГ УНЦ РАН.

Продолжительность исследования составила 6 недель. Эффективность нейролептиков у больных шизофренией оценена с использованием шкал позитивных и негативных синдромов (Positive and negative Syndrome Scale, PANSS), разработанная С. Кэй, Л. Оплер и А. Фишбэйн в 1986 г., позволяющая проводить стандартизированную оценку различных векторов психопатологической симптоматики шизофрении — позитивной (POSIT), негативной (NEGAT) и общей психопатологической симптоматики (PSYCH), определять клинический профиль больного и прослеживать динамику состояния в процессе терапии. Эффективность терапии и развитие побочных эффектов оценивали в 1-й день назначения препарата, а затем на 21-й и 45-й дни.

По ответу на терапию нейролептиками больные были поделены на две группы: больных, у которых изменение баллов по шкале PANSS составляло 50% и более, определяли в группу реагирующих на терапию нейролептиками — Респондеры (Responders), остальных больных считали резистентными к ней — Нереспондеры (Non Responders). Экстрапирамидный синдром (ЭПС) является побочным эффектом, наблюдаемым у 20-30% больных шизофренией при длительном приеме типичных нейролептиков.

Критерием развития острого экстрапирамидного синдрома (ЭПС), вызванного приемом нейролептиков, послужило наличие балла выше 3 по шкале SAS (шкала оценки экстрапирамидного синдрома, вызванного приемом нейролептиков).

Для идентификации генетических маркеров риска развития шизофрении были применены следующие подходы: анализ ассоциаций генов-кандидатов (метод случай-контроль) в этнических группах русских и татар из Республики Башкортостан.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ: MS Office Excel 2003 [Microsoft], Statistica v.6.0, BIOSTAT. При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля будет использовался критерий χ2 (P) для таблиц сопряженности 2*2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Сила ассоциаций оценивалась в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR). Анализ сочетаний генотипов и аллелей различных генов проведен с использованием пакета прикладных программ SPSS 13.0. Для анализа межгенных взаимодействий будет использована программа MDR (Multifactor-Dimensionality Reduction) и ее модифицированная версия, выпущенная позднее, GMDR (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction). Расчет показателя D’, используемого для оценки неравновесия по сцеплению пары полиморфных локусов, а также определение частот гаплотипов в изученных выборках осуществлялся с помощью программы Haploview V. 4.1.

Проведен анализ ассоциации между значениями по шкалам PANSS и SAS и генотипами (аллелями) больных ПШ русских и татар из РБ с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) (пакет прикладных программ «SPSS V. 13.0») для идентификации генетических маркеров индивидуальной чувствительности к нейролептикам.

ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Амплификацию изученных локусов проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе «Терцик» производства компании «ДНК-технология» (г. Москва). Для амплификации использовали реакционную смесь объемом 25 мкл, которая содержала 2,5 мкл 10хТаq-буфера (67 мМ трис-НС1 (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2 SO4, 1,5 мМ MgCl2, 0,01% Tween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP по 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Силекс», г. Москва) и 5-10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Для определения нуклеотидных замен методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) проводили гидролиз амплифицированных фрагментов соответствующей рестриктазой.

Результаты ПДРФ-анализа оценивались путем проведения вертикального электрофореза в 7-процентном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.