Амилоид-деградирующие ферменты

Несмотря на то что накопление Aβ в ткани мозга длительное время считалось необратимым процессом, сравнительно недавно было обнаружено существование эндогенных биохимических путей его деградации и удаления из ткани мозга. Как было показано рядом авторов, некоторые хорошо известные протеазы мозга способны гидролизовать Aβ в физиологических условиях. Это привело к пересмотру имеющихся представлений о метаболизме амилоидного пептида. К числу основных амилоид-деградирующих ферментов сейчас относят неприлизин (НЕП), эндотелин-конвертирующий фермент (ЕСЕ-1), инсулин-деградирующий фермент (ИДФ; инсулизин) и плазмин, которые способны расщеплять Aβ как in vitro, так и in vivo. На рис. 4 схематично показаны участки молекулы Аβ, на которых возможно его протеолитическое расщепление различными ферментами. Снижение уровня экспрессии или активности этих ферментов при патологических условиях может вести к накоплению Aβ и развитию БА или других нейродегенеративных патологий. С другой стороны, повышение экспрессии и активности амилоид-деградирующих ферментов как фармакологическими средствами, так и посредством генной терапии открывает новое направление в профилактике и терапии Ap-опосредованной нейродегенерации и БА.

Неприлизин. Неприлизин (НЕП, нейтральная эндопептидаза-24.11) является цинкзависимой металлопептидазой, впервые описанной в ткани почек как фермент, деградирующий пептидные гормоны. Этот фермент также известен как энкефалиназа благодаря его способности расщеплять энкефалин и прерывать пептидергическую нейропередачу. НЕП представляет собой мембраносвязанный гликозилированный эктофермент с молекулярным весом 93 кДа, активный центр которого обращен во внеклеточное пространство. НЕП способен расщеплять пептидные связи внутри молекул низкомолекулярных пептидов по гидрофобным аминокислотным остаткам. НЕП обладает довольно широкой субстратной специфичностью и регуляторной активностью. Благодаря этим свойствам НЕП принимает участие в регуляции разнообразных физиологических процессов, включая сердечно-сосудистую деятельность, воспалительные процессы, миграцию и пролиферацию клеток, а также развитие опухолей. Ключевая роль НЕП в деградации нейропептидов подтверждает возможную физиологическую роль Аβ, предложенную А.Р. Кудиновым и Т.Т. Березовым, поскольку Aβ также является одним из физиологических субстратов НЕП. НЕП присутствует в головном мозге в относительно низких количествах. Так, например, если в ткани почек его содержание составляет 4% от общего содержания всех белков, то в ткани мозга его в 1000 раз меньше.

Способность НЕП расщеплять Аβ-пептиды делает его важным участником на арене исследований патогенеза БA. Поскольку НЕП способен расщеплять не только мономеры, но также олигомерные формы Aβ(1-40) и Aβ(1-42), это его свойство является особенно важным для предотвращения образования более токсичных олигомерных форм Aβ пептида. В предварительных клинических исследованиях было показано, что содержание НЕП и его мРНК у пациентов с БA является достоверно более низким, чем у контрольных пациентов соответствующего возраста. В предпринятом недавно в Японии эпидемиологическом исследовании было показано существование корреляции между уровнем экспрессии гена НЕП и развитием старческой формы БA, однако другие исследователи не смогли выявить наличие такой корреляции.

Неприлизин 2. Относительно недавно был обнаружен гомолог НЕП, названный НЕП2 (также известный как NL1 и SEP), экспрессия которого в головном мозге свойственна, в основном, развивающимся и дифференцирующимся областям ЦНС и комплиментарна распределению НЕП, присутствуя в ограниченных популяциях нейронов, в спинном мозге, гипофизе и сосудистом сплетении мозга. У мышей НЕП2 также обнаружен в большинстве переферических органов, хотя преимущественным местом его локализации является тестис. Важно отметить, что НЕП2 человека и грызунов (мышей и крыс) обладают разными паттернами экспрессии, ферментативными свойствами и чувствительностью к ингибиторам, что необходимо учитывать при экстраполяции данных, полученных на трансгенных мышах, для оценки функциональной роли этого фермента в ткани мозга человека. Анализ субстратной специфичности НЕП и НЕП2 человека показал, что они оба интенсивно расщепляют Aβ и НЕП2 обладает большим сродством к этому субстрату. Принимая во внимание характер распределения НЕП2 и его ферментативные особенности, предполагают, что он является важным амилоид-деградирующим ферментом и расширяет диапазон возможности клеток и тканей катаболизировать Aβ. Недавние клинические исследования также выявили изменение уровня экспрессии НЕП2 в разных участках мозга при мягком когнитивном снижении, что позволяет рассматривать его в качестве одного из маркеров доклинической стадии БA.

Эндотелин-конвертирующий фермент. Другим кандидатом на роль амилоид-деградирующего фермента является эндотелин-конвертирующий фермент (endothelin-converting enzyme, ECE-1, ЭКФ). ECE-1 является мембраносвязанным белком, на 37% гомологичным по аминокислотной последовательности НЕП (в случае сравнения белков крысы). ECE-1 также является цинк-зависимой металлопротеазой и его основная физиологическая роль состоит в превращении большого эндотелина, в мощный вазоконстриктор эндотелии-1.

ECE-1 был впервые изолирован из легких крыс, а затем обнаружен в большом числе органов и тканей. Наиболее обогащены этим ферментом эндотелиальные клетки, но он также экспрессируется в экзокринных клетках, мышцах, нейронах и глии. В гладкомышечных клетках ECE-1 находится в комплексе с α-актиновыми филаментами. Сравнивая ECE-1 гетерозиготных и нокаутных мышей, Е.А. Экман и коллеги показали, что концентрация Аβ-пептидов в их мозге существенно выше, чем у контрольных животных, и имеет ген-зависимый характер. Как было показано этими авторами, растворимый рекомбинантный ECE-1 в условиях in vitro обладает способностью гидролизовать синтетические Aβ40 и Aβ41 на множественных участках (рис. 4).

Существует еще один белок, подобный ЕСЕ, который кодируется специфическим геном и носит название ЕСЕ-2. ЕСЕ-2, в основном, локализован в мозге и представлен незначительными количествами в эндотелиальных и гладкомышечных клетках. ЕСЕ-2 имеет 59% идентичности с ECE-1, но отличается от него кислотным pH-оптимумом, будучи практически неактивным при нейтральных pH. Он локализован в секреторных компартментах клеток где, вероятно, принимает участие в деградации белков. ЕСЕ-2, как и ECE-1, может катаболизировать Аβ, хотя оба этих фермента расщепляют разные его пулы — секретируемый и цитоплазматический.

Инсулин-деградирующий фермент. Еще одним ферментом, способным расщеплять Аβ, является цинк-зависимая металлопептидаза, инсулин-деградирующий фермент (ИДФ, инсулизин). ИДФ, в основном, локализован в цитозоле, но также обнаруживается в пероксисомах. Небольшие количества этого фермента находят в плазматических мембранах, а также во внеклеточной среде, хотя механизм секреции ИДФ пока не известен. Совсем недавно появились данные о том, что продукт альтернативной транскрипции ИДФ генерирует митохондриальную изоформу этого фермента, которая способна расщеплять некоторые митохондриальные белки. ИДФ расщепляет субстраты предпочтительно по гидрофобным и основным остаткам аминокислот, однако этот процесс не является строго последовательность-специфичным (см. рис. 4). Он обладает способностью расщеплять in vitro широкий спектр физиологических субстратов и имеет другие физиологические функции помимо инсулинового метаболизма. Было высказано предположение, что специфичность ИДФ обуславливается конформацией субстрата и его размерами с предпочтением к более крупным молекулам. Как было показано, ИДФ обладает специфичностью к ращеплению Аβ, ассоциированного с семейными мутациями гена APP.

Роль ИДФ в катаболизме Aβ была впервые предположена И.В. Курочкиным и С. Гото и исследовалась далее Д.Дж. Селко и коллегами. Принимая во внимание внутриклеточную локализацию ИДФ, было высказано предположение, что он может быть вовлечен в деградацию внутриклеточного Аβ. Гипотеза о том, что снижение активности ИДФ может вести к развитию БА, была поддержана работами А. Перез и коллег. Недавно выведенная линия трансгенных мышей, моделирующих БА (McGill-Thy1-АРР), и характеризуемая значительным снижением экспрессии ИДФ на ранней преклинической стадии развития патологии, рассматривается сейчас как важный инструмент в изучении механизмов регуляции и восстановления активности этого фермента.

В сравнительном исследовании ими было показано существенное снижение активности ИДФ в мозге пациентов, страдающих БА, по сравнению с контрольными пациентами того же возраста. Напротив, повышенная экспрессия ИДФ, как и НЕП, в нейронах мозга трансгенных мышей приводила к существенному снижению уровня секретируемого ими Аβ, препятствовала формированию амилоидных депозитов и связанной с ними цитопатологии, а также предотвращала преждевременную гибель АРР-мутантных животных. Тем не менее, интракраниальные инъекции адено-ассоциированных векторов (AAV), экспрессирующих НЕП или ИДФ трансгенным мышам, показали, что только НЕП-содержащий вектор действительно приводил к снижению амилоидной патологии, что снижает потенциал возможного применения ИДФ-векторов для терапии БA.

Помимо Aβ ИДФ также обладает способностью гидролизовать цитоплазматический фрагмент APP — AICD. Повышение экспрессии ИДФ в клетках как экстраневрального так и нейронального происхождения приводило к значительному снижению в них AICD. Тем не менее, при полном ингибировании ИДФ не наблюдалось существенного повышения уровня внутриклеточного AICD, что свидетельствует о наличии альтернативных путей его деградации.

В литературе имеются данные, связывающие патогенез BA с действием и патологией метаболизма инсулина, в связи с чем BA часто называют дабетом 3 типа. Предполагается, что инсулин и инсулиноподобные факторы, которые играют определенную роль в обучении и памяти, также могут быть вовлечены в развитие патологических процессов, ведущих к БA. Более того, нарушение метаболизма глюкозы также является одним из характерных признаков БА. Как было показано, экспрессия инсулиновых рецепторов повышена в мозге больных, страдающих БA, но имеет нарушенный сигнальный механизм. В опытах по рецепторному связыванию было обнаружено, что Aβ(1-40) и Aβ(1-42) снижают способность инсулина связываться со своими рецепторами, а также блокируют автофосфорилирование рецепторов. Напротив, обращенный пептид Aβ(1-40) не изменяет связывание инсулина с рецепторами и их автофосфорилирование. Это позволяет предположить, что Aβ(1-40) и Aβ(1-42) являются непосредственными конкурентными ингибиторами рецепторного связывания и действия инсулина.

Рядом авторов предполагается наличие общих механизмов развития гиперин-сулинемии, диабета и БА. Так, с использованием генетически модифицированных линий мышей было показано, что полное отсутствие аллелей гена ИДФ (-/-) приводит более чем к 50-процентному снижению уровня катаболизма Aβ как в мембранных фракциях мозга, так и в первичных нейрональных культурах, полученных из мозга этих животных. При этом в печени этих животных также наблюдается пониженное расщепление инсулина. ИДФ (-/-) мыши помимо увеличенного накопления в ткани мозга эндогенного Aβ также демонстрировали гиперинсулинемию и нетерпимость к глюкозе, характерные для диабета второго типа. Эпидемиологические исследования также свидетельствуют в пользу того, что инсулин-независимый диабет второго типа связан с повышенным риском развития БA.

Генетические изменения внутри или вблизи гена ИДФ также связывают с увеличением риска и тяжести БА. В частности, на 10-й хромосоме был обнаружен большой участок (размером более 60 мегапар оснований), включающий ген ИДФ, который сопряжен с риском развития БA. Генетические изменения на этом участке ДНК позволили идентифицировать аллели риска развития БA с эффектом, сравнимым по своей значимости с мутацией аллели ε4 аполипопротеина E. Однако генетические исследования в Японии и Франции не подтвердили наличия связи между полиморфизмом гена ИДФ и повышением вероятности возникновения как ранней, так и старческой форм БA. Напротив, другая группа исследователей обнаружили равновероятностное присутствие как нарушающих, так и протекторных аллелей гена ИДФ, связанных с патогенезом не только БA, но также и болезни Паркинсона.

Плазмин. Плазмин (ЕС 3.4.21.7) является сериновой протеиназой, образующийся из неактивного зимогена, плазминогена, в результате действия других сериновых протеаз, называемых активаторами плазминогена. Плазмин расщепляет многие компоненты внеклеточного матрикса и в плазме крови действует, в основном, как тромболитический фактор. В мозге плазминогеновая система вовлечена в многочисленные функции, такие как нейрональная пластичность, поддержание уровня нейротрофинов, функционирование холинергической системы, долгосрочная потенциация посредством деградации ламинина, обучение и память. При фокальной церебральной ишемии наблюдается активация плазминогеновой системы в мозге, сохраняющаяся в течение нескольких дней после инсульта, что предполагает ее участие в процессах деструкции внеклеточного матрикса, вторичных кровотечениях и отеке мозга. Уровень плазмина также снижен в ткани мозга пациентов, страдающих БA, особенно в гиппокампе.

Роль плазмина в патогенезе BA пока полностью не ясна, хотя в литературе есть ряд наблюдений, свидетельствующих о способности плазмина катаболизировать амилоидный пептид. Так, было показано, что очищенный плазмин способен расщеплять Aβ с физиологически значимой эффективностью, равной 1/10 скорости расщепления им фибрина. При этом масс-спектрометрический анализ показал, что плазмин гидролизует Aβ в нескольких местах (см. рис. 4), а данные электронной микроскопии подтвердили, что плазмин способен расщеплять также Aβ фибриллы. Более того, экзогенно добавленный к клеткам плазмин способен блокировать нейротоксичность, вызванную Aβ. Исследования ткани мозга трансгенных APP/PS1 мышей, у которых также отсутствует ген ингибитора активатора плазминогена PAI-1, выявили более низкое содержание у них Ар, что указывает на участие плазмина в его катаболизме.

В работе И.Б. Кингстона и коллег показано, что агрегированные формы Aβ in vitro способны стимулировать энзиматическую активность тканеспецифического активатора плазминогена (tPA). Образующийся в результате этого плазмин специфически расщепляет Aβ таким образом, что усиливаются его свойства к образованию β-складок и агрегации. Это, в свою очередь, ведет к дальнейшей стимуляции tPA и более усиленной продукции плазмина. Такой механизм обратной связи может играть отрицательную роль, поскольку избыточный протеолиз белков, вызванный активацией плазминогена, может вести к разрушению клеток сосудов головного мозга и кровоизлияниям.

Основным эндогенным ингибитором tPA в ткани мозга является белок нейросерпин, синтезируемый в нейронах. При БA в мозге имеет место повышение содержания нейросерпина и снижение активности плазмина. При нокауте гена нейросерпина у трансгенных hAPP-J20 мышей, моделирующих БA, наблюдалось резкое снижение содржания Aβ42, сопровождавшееся улучшением когнитивных функций, по сравнению с животными с активным геном нейросерпина. Однако, несмотря на многочисленные данные, свидетельствующие об участии плазминовой системы в катаболизме амилоидных отложений, другая группа исследователей не смогла выявить существенных изменений экспрессии плазминогена на уровне мРНК и белка в ткани мозга при БA. Ho поскольку эти исследования проводились post mortem, интерпретация полученных данных должна проводиться с осторожностью. Другой группе исследователей также не удалось выявить различий в уровне содерждания t-PA, плазминогена и PAI-1 в ЦСЖ больных и здоровых людей, хотя они не отвергают роли плазминонгеновой системы в расщеплении амилоида и патогенезе БA.

В составе плазматических мембран плазмин находится в ассоциации с холестерин-обогащенными микродоменами, так называемыми липидными рафтами, которые считаются местами преимущественного образования амилоидного пептида. Это также свидетельствует о наличии функциональной связи между плазмином, холестерином и метаболизмом Aβ.

Рядом авторов было показано, что агрегированные формы Aβ также способны повышать уровень мРНК, кодирующих тканеспецифические активаторы плазминогена урокиназного типа (uPA), который тоже связывают с патогенезом BA. Как было показано в работах нескольких исследовательских групп, локус на хромосоме 10, связанный с фамильной формой БA, содержит в своем составе ген урокиназного активатора плазминогена. Эти авторы также продемонстрировали, что комбинация uPA и плазминогена вместе, но не по отдельности, ингибируют токсичность Аβ, снижая его фибрилогенез и формирование депозитов Аβ.

Поиск генетической связи между плазмином и риском развития БA пока не позволяет сделать однозначные заключения, хотя имеются данные, связывающие уровень содержания Aβ42 с полиморфизмом гена активатора плазминогена урокиназного типа (PLAU) на хромосоме 10 и спорадической формой БA. В проведенном недавно исследовании, сравнивающем 14 наиболее часто встречающихся вариаций генов, кодирующих компоненты плазминовой системы, не было подтверждено, что полиморфизм этих генов связан с частотой встречаемости БA.

Фармакологическая или генетическая регуляция плазминогеновой системы пока остается одной из возможных стратегий профилактики и лечения БA, поскольку плазмин способен эффективно удалять внутриклеточные мономерные и внеклеточные фибриллярные формы Ар. Низкомолекулярные ингибиторы активатора плазминогена (PAI-1) могли бы эффективно поддерживать активность плазминовой системы на желательно высоком уровне. Однако, поскольку плазмин также вовлечен в метаболизм фибрина, создание такой терапии следует проводить с осторожностью во избежание побочных эффектов в виде кровотечений.

Ангиотензин-конвертирующий фермент. Ангиотензин-конвертирующий (ангиотензин-превращающий фермент, АКФ, АСЕ) является ключевым компонентом ренин-ангиотензиновой системы (РАС) как в ЦНС, так и на периферии. АСЕ регулирует кровяное давление и функции сердечно-сосудистой системы посредством превращения ангиотензина I в мощный вазоконстриктор ангиотензин II и одновременно посредством инактивации вазодилятора брадикинина. Наличие связи между АСЕ и патогенезом БA было показано в генетических исследованиях, а метаанализ данных литературы с еще большей убедительностью показал существование прямой связи между РАС, развитием гипертензии, гипоксией/ишемией мозга и БA. Полиморфизм гена DCP на хромосоме 17ql3, кодирующего АСЕ, ассоциирован с высоким риском развития BA, особенно в случае инсерций или делеций (I/D) на участке нитрона 16. Кроме этого существует связь между развитием старческой формы BA и полиморфизмом на других участках гена АСЕ. В этой связи встает закономерный вопрос о том, что определяет связь между БA и АСЕ: его свойства, связанные с РАС, или способность расщеплять Аβ. В отличие от НЕП и ИДФ, при БA уровень содержания и активность АСЕ в ткани мозга, в частности в гиппокампе, фронтальной коре и хвостатом ядре, значительно выше, чем в норме. Повышение активности АСЕ может непосредственно вести к когнитивным нарушениям в результате гиперпродукции ангиотензина II, который оказывает ингибирующий эффект на высвобождение ацетилхолина.

Как было показано Дж. Xy и соавторами, АСЕ способен расщеплять Аβ, а также ингибировать формирование его агрегатов и токсичность в условиях in vitro, и эти свойства АСЕ подавляются в присутствии его специфического ингибитора лизиноприла.

Амилоид-деградирующие свойства АСЕ были подтверждены в работе, где было показано, что АСЕ расщепляет как Aβ1-40, так и Aβ1-42, и что ингибиторы АСЕ приводят к накоплению Aβ в АРР-экспрессирующих клетках СНО. Более того, как оказалось, АСЕ способен превращать токсический Aβ1-42 в менее патогенный Aβ1-40. Введение АСЕ ингибитора кап-топрила трансгенным мышам Tg2576, используемым как модель БА, приводило к ускоренному накоплению в ткани мозга Ар, в частности его более патогенной формы Aβ1-42. Эти данные свидетельствуют, что умеренное повышение активности АСЕ может представлять терапевтическую ценность для терапии нейродегенерации и БA. С другой стороны, вызывает опасение, что длительное применение ингибиторов АСЕ для лечения гипертензии может повышать риск развития БА. В развитие этого предположения был проведен анализ изменений уровня Aβ на периферии и образования амилоидных отложений в ткани мозга, при использовании других ингибиторов АСЕ, которое не подтвердило это опасение. Клиническое исследование большой группы пациентов в Японии показало, что применение ACE-ингибиторов, способных проникать через гематоэнцефалический барьер (например каптоприл) и ингибировать АСЕ в ткани мозга, коррелирует с более низким процентом развития БA, чем при применении ингибиторов, которые не способны ингибировать мозговую форму АСЕ (например лизиноприл). В связи с этим высказывается предположение о существовании связи между активностью АСЕ и развитием церебральной амилоидной ангиопатии, поскольку при этой патологии показано повышение уровня содержания и активности АСЕ, вероятнее всего нейронального происхождения, в периваскулярных районах мозга.

В литературе имеются убедительные данные о наличии генетической связи между полиморфизмом АСЕ и развитием спорадической формы БA. Более того, была показана связь между полиморфизмом этого гена и развитием мягкого когнитивного снижения амнестического типа.

Матричные металлопротеиназы. Матричные металлопротеиназы (MMП) представляют собой еще один класс ферментов, которые в условиях in vivo могут катаболизировать не только АРР, но и Aβ (см. рис. 4 ). Так, было показано, что Aβ1-40 является субстратом ММП-2 (желатиназы А), ММП-3 (стромелизина), ММП-6 и ММП-9 (желатиназы Б). Более того, Aβ способен повышать уровень экспрессии этих ферментов. Среди перечисленных ферментов ММП-9 является наиболее изученной в отношении специфичности к Aβ. Эти авторы показали связь между характером распределения ММП-9 и уровнем содержания Aβ и обнаружили присутствие этого фермента в непосредственной близости от амилоидных бляшек. ММП-9 in vitro способна расщеплять Aβ40 на нескольких участках, но основным местом ее действия является связь между Leu(34) и Met(35) (см. рис. 4). ММП-2 и ММР-9 были также обнаружены в астроцитах, окружающих амилоидные отложения в мозге стареющих APP/PS1 и APPsw трансгенных мышей, где они, по-видимому, играют роль в расщеплении Aβ. ММП-9, как и плазмин, способна расщеплять не только мономерные, но и фибриллярные формы Ар. Уровень ММПз и их способность расщеплять Aβ изменяется под воздействием различных факторов. Так, в условиях in vivo содержание Aβ может быть снижено путем добавления лиганда металлов кликинола и ионов меди (Cu2+), которые повышают уровень экспрессии ММП-2 и ММП-3, что может иметь определенное терапевтическое значение.

Несмотря на наличие убедительной связи между уровнем активности ММПз и амилоидным метаболизмом, в эпидемиологическом исследовании образцов мозга не было выявлено различий в уровне экспрессии и активности ММП-2, -3 и -9 во фронтальной коре при БА и в нормальном мозге. На генетическом уровне также не было показано наличие корреляций между полиморфизмом генов ММП-3 и ММП-9 и риском развития БА, хотя эти полиморфизмы были связаны с другими заболеваниями. С другой стороны, у людей, не являющихся носителями е4 аллели аполипопротеина Е, наблюдается меньший риск развития БА, связанный с определенными полиморфизмами ММР-3 и ММП-9. Более того, недавно было показано, что защитные эффекты эстрогенов против амилоидной токсичности обусловлены активацией ММП-2 и -9 и соответствующим повышением катаболизма Aβ.

Катепсин В. За последние годы накоплено довольно большое число данных о роли лизосомальной сериновой протеиназы, кетепсина В, в метаболизме APP и Aβ пептида. Этот фермент был предложен в качестве альтернативной β-секретазы, действующей преимещественно на нативные (генетически не модифицированные, как в случае семейных форм БА) молекулы APP. Также было показано, что ингибиторы катепсина В снижают когнитивный дефицит и понижают содержание Aβ в мозге мышей с моделированием БА. Это согласуется с данными исследований, свидетельствующих, что нейропротекторные свойства катепсина В обусловлены его способностью расщеплять Аβ, в частности Aβ41. Напротив, на модели катепсин В-трансгенных мышей, лишенных этого гена и экспрессирующих APP человека с семейными мутациями, было показано повышение накопления Aβ42, сенильных бляшек и когнитивный дефицит. Также недавно было установлено, что катепсин В способен расщеплять С-концевые фрагменты АРР, в том числе и AICD, что указывает на участие эндосомально-лизосомной системы в метаболизме APP и его фрагментов.

Действие катепсина В на Aβ41 сходно с таковым у АСЕ, поскольку он проявляет активность дикарбоксипептидазы с оброазованием сначала Aβ40, а потом Аβ38, тем самым снижая токсичность амилодного пептида. В результате эндопептидазной активности катепсина В также образуется Aβ33. Этот фермент также способен расщеплять олигомеры Aβ и его фибриллы и действовать как внутри нервных клеток (в лизосомах), так и снаружи, поскольку он интенсивно секретируется активированной микроглией, в частности в ответ на действие Aβ. В связи со сложившимися представлениями о роли катепсина В в расщеплении амилоидного пептида было высказано предположение, что повышения его активности в ткани мозга можно добиться путем инактивации его эндогенных ингибиторов, в частности цистатина С. Действительно, при нокауте гена цистатина 3 (CST3) у hAPP-J20 трансгенных мышей наблюдалось значительное снижение уровня растворимого Аβ, в частности Aβ41, и сенильных бляшек. Удаление гена цистатина С приводило не только к нормализации Aβ-ассоциированного когнитивного дефицита и нарушений в поведении, но также к восстановлению синаптической пластичности в гиппокампе. К удивлению, оверэкспрессия цистатина С у трансгенных hAPP-J20 мышей также приводила к снижению уровня сенильных бляшек, но, как оказалось, это осуществлялось по механизму, не связанному с активностью катепсина В, а путем взаимодействия цистатина С непосредственно с самим Аβ, что препятствовало образованию его токсичных олигомеров и фибрилл.

Генетические исследования показали наличие связи между полиморфизмом гена цистатина С, который снижает его секрецию, и риском развития спорадической формы БА, что явилось первым свидетельством наличия аутосомно-рецессивной аллели, связанной с риском развития этой формы БА. Позднее это было подтверждено данными системного метаанализа. Исследования катепсина В и цистатина С указывают на важность анализа как каждого индивидульного фермента, так и системы его эндогенных ингибиторов для регуляции метаболизма Аβ. Это позволит с большей точностью идентифицировать наиболее перспективные терапевтические мишени для профилактики и лечения БA с минимальными побочными эффектами.

Другие ферменты. Несмотря на довольно широкий спектр амилоид-деградирующих ферментов, обнаруженных к настоящему времени, их число продолжает расти. Еще одним физиологически значимым кандидатом на эту роль является пептидасома PreP, которая регулирует уровень содержания Aβ в митохондриях. PreP является родственной по свойствам, но не идентичной ИДФ, и принимает участие в расщеплении различных коротких митохондриальных пептидов, в том числе и Aβ на нескольких участках его молекулы (см. рис. 4). При БA и у трансгенных мышей в митохондриях клеток мозга наблюдается накопление Аβ, что приводит к снижению активности митохондриальных ферментов и угнетению функций митохондрий. Накопление Aβ в митохондриях, в основном в его более патогенной форме Aβ41, наблюдается задолго до образования внеклеточных отложений амилоидных фибрилл и является возможной причиной изменения клеточных функций и их гибели при БA. Хотя до настойщего времени не было выявлено никаких ассоциаций между полиморфизмами гена PreP и риском развития БA, пониженная протеолитическая активность PreP была отмечена в митохондриях мозга при БA по сравнению с контролями того же возраста.

Совершенно неожиданно среди потенциальных кандидатов на роль амилоид-деградирующих ферментов оказался основной белок миелина (МБР), который, как полагают, обладает эндогенной активностью сериновых протеаз, приводящей к аутокаталитическому расщеплению его белковой молекулы. Как было показано, MBP также способен связываться с Аβ, предотвращая его агрегацию.

К числу ферментов, которые могут представлять терапевтический интерес для нейропротекции, также относят цинк-зависимую эндопептидазу, аминопептидазу А(АР-А). Этот фермент специфично удаляет N-концевые аминокислотные остатки и играет важную роль в центральной регкуляции кровяного давления посредством превращения ангиотензина II в ангиотензин III. Поскольку содержание укороченных с N-конца молекул Аβ, в частности Aβ2-42, существенно повышено при БA и они обладают высокой токсичностью, снижение активности AP-A может быть терапевтически выгодно. С другой стороны, при действии AP-A образуется субстрат другой аминопептидазы (АР-N), действие которой приводит к доступности остатка N-концевого глутамина для циклизации при участии глутаминил-циклазы, продукты которой тоже очень токсичны. Инактивация AP-А, таким образом, может иметь нейропротекторный характер, препятствуя инициации каскада протеолитических реакций, высвобождающих целый ряд токсичных N-трункированных форм амилоидного пептида.

Еще одна полифункциональная цинк-зависимая эктопептидаза, а именно глутамат-карбоксипептидаза II (GCP II), в ткани мозга приводит к расщеплению широко распространенного нейротрансмиттера N-ацетил-аспартил-глутамат (NAAG). Последний, как было показано, вовлечен в патогенез ряда неврологических состояний, и ингибиторы этого фермента имеют нейропротекторные свойства. В мозге человека этот фермент вырабатывается в основном в астроцитах и, как было показано, способен расщеплять Aβ40 и Aβ42, с образованием Aβ1-14, Aβ1-18 и Aβ1-35, которые не обладают токсичностью. Введение специфического ингибитора GCPII трансгенным мышам, моделирующим БА, приводило к повышению уровня Ар. Напротив, повышение экспрессии GCP II в нейронах и глии способствовало снижению образования Aβ и его токсичности. Это позволяет рассматривать GCP II как еще одного функционального участника контроля за уровнем накопления Aβ в условиях in vivo. Более того, этот фермент способен снижать уровень не только мономерных, но и олигомерных форм Aβ и его фибрилл, а также сенильных бляшек, что позволяет рассматривать его как потенциально важную терапевтическую мишень, хотя более детальные клинические исследования еще ждут своего проведения.

Другие агенты неферментативной природы. Нет никаких сомнений в том, что помимо классических протеолитических ферментов существуют и другие агенты, способные ускорять катаболизм Aβ in vivo. Например, было показано, что два фрагмента легких цепей антител также обладают протеолитической активностью по отношению к Aβ. Первый из них демонстрирует активность, подобную α-секретазе (с23.5), и ведет к образованию 1-16 и 16-40 фрагментов Aβ (см. рис. 4). Второй фрагмент обладает карбоксипептидазной активностью, отщепляя последовательно по одной аминокислоте от С-концевой части молекулы Аβ. В дополнение к этому, расщепление Aβ40 фрагментом легкой цепи антител hk14 приводит к изменению его агрегационных свойств и нейтрализует цитотоксический эффект Aβ. Напротив, расщепление Aβ40 фрагментом легкой цепи антител с23.5 ведет к увеличению скорости агрегации образующихся продуктов, не увеличивая при этом их токсичность в условиях in vivo. Результаты этих исследований свидетельствуют, что фрагменты антител способствуют протеолитической деградации Aβ и, таким образом, имеют потенциальную терапевтическую значимость для контроля уровня образования, агрегации и токсичности Aβ в условиях in vivo. С другой стороны, эти данные заставляют с осторожностью относиться к предлагаемому методу контролируемого образования Aβ путем повышения активности а-секретазы, поскольку это может вести к увеличению агрегационных свойств амилоидного пептида с образованием более токсичных олигомеров.

Еще одним фактором, способствующим снижению уровня эндогенного Аβ, является глюкагонподобный пептид (GLP-1). Локализация рецептора GLP в головном мозге человека и грызунов коррелирует с центральной ролью этого пептида в регуляции потребления пищи, однако также было показано, что стимуляция нейрональных GLP-1-рецепторов регулирует нейрональную пластичность и выживаемость нейронов. GLP-1 является естественным аналогом экзендина-4, который, как было установлено, снижает уровень эндогенного Aβ в паренхиме мозга мышей и уровень APP в нейронах. Поскольку GLP-1 активирует рецепторы, сопряженные с G белками, его действие посредством индукции синтеза цАМФ, может влиять на многие функции клетки, в том числе на их выживаемость. Это делает GLP-1 и другие агонисты рецепторов 2 класса, сопряженных с G-белками, потенциально важными агентами для развития новых стратегий лечения БA.

Помимо ферментов в поддержании амилоидного гомеостаза в ткани мозга принимают также участие белки-переносчики, которые способны связывать и выводить Aβ по периваскулярным путям. К их числу относятся аполипопротеины (АроЕ), связь которых с патогенезом БA уже рассматривалась выше, но точный механизм действия которых пока не установлен, а также переносчик тироксина — транстиретин (TTR). Последний представляет особый интерес, поскольку его регуляция в нервных клетках осуществляется сходным с неприлизином образом. TTR, в основном образуется в сосудистом сплетении мозга, но он также может экспрессироваться и нервными клетками. В литературе есть указание на то, что TTR может проявлять пептидазную активность, но функциональный вклад этого белка в качестве фермента в катаболизм Aβ еще нуждается в подтверждении. Тем не менее, имеются убедительные данные о роли TTR в защите нервных клеток от повреждающего действия Aβ и восстановлении когититивных свойств у животных. С возрастом и при БA уровень TTP в ткани мозга существенно снижается, что указывает на актуальность изучения механизмов регуляции его экспрессии, а также поиск соединений, способствующих нормализации его функций.