Адаптивный ответ сетчатки глаза на введение метилнитрозомочевины и облучение ускоренными протонами

Декабрь 8, 2015 / Комментарии 0

В предыдущих экспериментах продемонстрирована способность клеток сетчатки к восстановлению структуры ДНК от генотоксических повреждений: спустя 24-48 ч после инъекции ретинотоксической дозы MHM (70 мг/кг) наблюдалось удаление дефектов и восстановление ДНК (рис. 11Б). Однако несмотря на полную репарацию, происходила деструкция сетчатки, гибель фоторецепторов и необратимая утрата функций. Это говорит о том, что репарация ДНК от повреждений хотя и необходимое условие для клеточного восстановления сетчатки, но не является исчерпывающим показателем. В этой же части исследований мы наблюдали способность сетчатки глаза к функциональному восстановлению, но после инъекции нецитотоксической дозы MHM 35 мг/кг (см. рис. 10). В силу сказанного в последующих экспериментах мы использовали клеточную гибель/выживаемость и функциональную активность (ЭРГ) как показатели восстановления сетчатки глаза после генотоксического воздействия.

р11

Тактика эксперимента основана на фракционировании дозы агента и используется в токсикологии для характеристики адаптации организма к токсическому агенту. Предполагается, что первое нетоксическое воздействие в низкой дозе, создает «защитный фон» в ткани, на котором последующее воздействие в высокой дозе становится менее токсичным. Этот эффект в литературе называется гормезисом. Исследования состояли из двух серий экспериментов. В первой серии в качестве адаптирующего воздействия использовали низкую дозу MHM (химический гормезис).

Рис. 12 представляет схему (А) и результат (Б) опыта по адаптивному ответу сетчатки глаза мышей на последовательное воздействие MHM сначала в нетоксической (17 мг/кг) и спустя 4 ч в токсической дозе 70 мг/кг. На этом рисунке результат представлен в виде профилей ЭРГ (А) и гистограммой амплитуд ЭРГ (Б). Как видно, через 6 ч после воздействия MHM в дозе 70 мг/кг профиль ЭРГ восстанавливается (ms3). Хотя амплитуда ЭРГ остается сниженной по сравнению с контрольной сетчаткой (ms1), она, тем не менее, достоверно выше амплитуды ЭРГ после единственной инъекции MHM в дозе 70 мг/кг (ms2).

р12

Адаптивный ответ по активации глиальных Мюллеровских клеток (ГКМ) в сетчатке глаза регистрировали спустя 48 ч после адаптирующей инъекции МНМ. Мюллеровские клетки сетчатки чутко реагируют на химическое воздействие. Ответ ГКМ (реактивный глиозиз) включает в себя увеличение размера ГКМ, пролиферацию и миграцию ГКМ к поврежденным участкам сетчатки и наиболее ранимому слою фоторецепторов. Эти 3 компонента ответа на MHM наблюдались на микросрезах в виде FITC-фокусов (рис. 13). Фокусы представляют собой пролиферирующие клетки, включившие BUdR в ДНК. Подсчет таких фокусов на единичную площадь среза дает количественную меру ответа ГКМ на стресс. В ответ на дозу 70 мг/кг (однократно) наблюдалась достоверная активация ГКМ (см. рис. 13Б).

р13

Фракционирование дозы MHM (17+70 мг/кг) обнаружило снижение активации ГКМ (рис. 14) по сравнению эффектом от дозы 70 мг/кг. Хотя это снижение недостоверно (Р=0,08), мы обращаем внимание на уверенную тенденцию к снижению активации ГКМ в сетчатке после фракционирования МНМ, что говорит о снижении повреждающего действия двух доз MHM по сравнению с одной 70 мг/кг.

Во второй серии экспериментов в качестве адаптирующего воздействия использовалось облучение протонами головы животных в дозе 1 Гр (радиационное прекондиционирование, гормезис). Как и в предыдущей серии, вторым (ударным) воздействием была внутрибрюшинная инъекция ретинотоксической дозы MHM 70 мг/кг.

Эвтаназия и препаративные процедуры проводились спустя 48 ч после облучения. Результаты представлены на рис. 15. Как видно, инъекция MHM в дозе 70 мг/кг приводит к массовой гибели фоторецепторов, о чем говорит локализация TUNEL-фокусов только в наружном ядерном слое сетчатки на микрофотографии (см. рис. 15А). Это же наблюдается и на вставках микрофотографий на рис. 15Б.

р15

Попутно отметим, что морфологическая деструкция фоторецепторного слоя сетчатки менее выражена, хотя наблюдается разупорядочение фоточувствительных сегментов фоторецепторов, те. апоптотическая деградация ДНК и активация эндонуклеаз в ядрах фоторецепторов сетчатки в данном случае опережает по времени морфологические изменения сетчатки примерно на 24-48 ч.

Количественная оценка интенсивности TUNEL-флуоресценции (см. рис. 15Б), проведенная с помощью программы Image J, показала достоверное снижение цитотоксичности MHM после протонного облучения в дозе 1 Гр по сравнению с эффектом только от MHM (уровень значимости различий р<0,001). Другими словами, предварительное облучение протонами головы мышей в дозе 1 Гр делает сетчатку

глаза более толерантной к цитотоксическому действию МНМ. Известно, что апоптоз в клетках инициируется двунитевыми разрывами ДНК, имеющими ферментативную природу. Поскольку, как отмечалось ранее, MHM не вызывает разрывов ДНК, то в апоптотических клетках сетчатки может наблюдаться формирование таких инициирующих апоптоз ферментативных двунитевых разрывов ДНК. Их содержание в клетках может коррелировать со средней скоростью апоптоза в сетчатке.

Как видно, полученные нами результаты оценки двунитевых разрывов ДНК в сетчатке подтверждают наши ожидания (рис. 16). Среднее содержание двунитевых разрывов ДНК в клетках сетчатки после совместного действия агентов ниже такового в сетчатке, подвергнутой действию только МНМ, что совпадает с частотой апоптоза по данным TUNEL (см. рис. 16Б, гистограммы).

р16

Подпишитесь на свежую email рассылку сайта!

Читайте также